RNAの電気泳動

質問

RNAの電気泳動についての質問です。
RNAをin vitroで作成し、できたRNAが目的の長さのものかどうか、スメアとなっていないか確かめるために行っています。マニュアルどおり（アガロースホルムアミド、サンプルにエチブロを混合）にやっているのですが、なかなかバンドが出てくれません。

(1)1レーンあたりサンプルRNAを2μg（吸光度より）流しているのですが、バンドが見えません。RNAだとDNAに比べてバンドが出にくいとかあるのでしょうか？5μg流したところでやっとバンドらしきものが見えました。
(2)さらに市販のRNAマーカーもバンドが出ません。マニュアルどおり1レーンあたり2μl使ってもバンドがなく、10μl使っても同様に見えませんでした。なにが悪いのでしょうか？RNaseには気をつけているつもりなのですが・・。マーカーが出ず、サンプルのサイズが不明なままなのです。なにか良い方法はないでしょうか？

DNAをメインに扱っていたもので疎い部分もありますが、よろしくお願い致します。

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

>マニュアルどおり（アガロースホルムアミド、サンプルにエチブロを混合）にやっているのですが、なかなかバンドが出てくれません。

そういうマニュアルがあるのかしら。ホルムアミドではなくフォルムアルデヒドでは？　EtBrを泳動バッファーとゲルに入れておくという方法はありますが、サンプルに混合というのもあまりスタンダードではないです。ErBrは核酸と逆方向に流れますから、泳動しているうちにどんどん離れていってしまいます。二本鎖だとインターカレートしたEtBrが多少は核酸といっしょに移動するでしょうが、変性状態のRNAではそれもほとんどないでしょう。

結論としては、泳動後のゲルをEtBr溶液中で染めるべきです。
検出感度は二本鎖（1バンド1ng前後）に比べ、RNAのような一本鎖では10倍くらい低いです。それもホルムアルデヒド存在下だとさらに低くなるので、場合によっては、ゲルを蒸留水などで何度か洗ってホルムアルデヒドを抜いてやる必要があります。

お礼

失礼致しました。ホルムアミドでなくホルムアルデヒドでした。
RNAが一本鎖であることが感度を低くしているのですね。
早速後染めを試してみたのですが、若干弱いながらもマーカーもサンプルもバンドを見ることができました。

ありがとうございました。大変助かりました。

回答No.4

geneticist12

私の勉強不足でした。
変性RNAサンプルにEtBrを混ぜて電気泳動する方法は80年代から数々報告があり、Molecular Cloning 3版にも常法として載っているのですね。どうやらインターカレーションによるのではなく、アルデヒド存在下で核酸とEtBrがある種の化学反応を起こすことで結合するようですね。

文献によると1バンド10 ng程度のRNAがあれば検出できるそうですから、ご質問にある例でも本来十分検出できるはずですね。
ひょっとするとRNAとEtBrとの反応が不十分なのかもしれません。
RNA、フォルムアミド、フォルマリンを混ぜて加熱する段階でEtBrを入れておいたほうが、熱変性後にEtBrを加えるより感度が上がるという記載もあります。
ご参考まで。

お礼

なるほど、勉強になります。EtBrはRNAサンプル加熱後に入れていました。もしかしたらこれが原因かもしれません。ありがとうございました。

回答No.3

tuyosi17

２の方が指摘されているようにアガロースホルムアミドというのが良く分かりませんが、一般的なホルムアルデヒドアガロースでMOPSバッファーでRNAを流した場合、ゲルにEtBrを入れたり、後染めをするより、サンプルにあらかじめ混ぜておいた方がはるかに強いシグナルが得られます。あらかじめ混ぜておいた方がEtBrが効率よく核酸に結合するためと思われます。結合していないEtBrは反対方向に流れますが、すでにサンプルに結合したEtBrは泳動中にそんなに簡単には外れないので問題ありません。１，２の方が言われることは一般的によく言われることですが、私の経験では先染めの方がはるかにバンドははっきり見えます。

それから、もしRNAのサイズが１Kb程度かそれ以下ならば変性PAGEで分離した方がバンドとしてはシャープにシグナルも強く見えます。私は転写したRNAは長さに応じて、３から８％のUrea変性PAGEで流して確認しています。PAGEならゲルも薄いですし、EtBrは後染めで1分程度で充分です。

お礼

ご回答ありがとうございます。あらかじめエチブロを入れておき、さらに後染めを行ったところ上手くいきました。なぜか、なぜか先染め（混合）だけではバンドが見えませんでした。RNAの量が少ないのでしょうか？普通はどのくらいの量を流せばみれるのでしょうか？
貴重なご意見ありがとうございました。

回答No.1

MIYD

EtBrはインターカレーターなので、一本鎖の場合は感度が低くなります。

サンプルにエチブロを混合とかかれていますので、
後染め(泳動後のゲルをエチブロ溶液に浸ける)はやっていないのでしょうか。
エチブロはRNAとは逆方向に泳動されるので、サンプルと混合して絵移動した場合には感度が低くなります。

お礼

ご回答ありがとうございます。後染めはやっておりませんでした。
なるほど、混合させてもエチブロが逆方向に向かうので感度が低くなるのですね。ありがとうございました。