ＰＣＲ後のアガロースゲル泳動について

質問

ＰＣＲで増幅後、確認のためプラスミド精製、エタノール沈殿をしてから、ＴＥに溶解後のサンプルを10μｌ泳動しました。
泳動後の結果を見てみると、とても発光が薄いバンドが見られました。（バンドが出た位置は大丈夫でした）いつもははっきり見えていたのにと思い、もう一度やってみましたが、結果は同じでした。私の研究室ではEtBrを先に入れてゲルを作っています。なにがいけないのかがわかりません。一緒に入れたＤＮＡマーカーも薄いです。この発光の濃淡はＤＮＡ濃度とも関係してくるのでしょうか？わかりにくい質問ですみません。よろしくお願いします。

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

先染めで薄かったら、そのまま後染めをして見ましょう。
ゲルにいれたEtBr濃度が低かったからとか、EtBrが溶出しているとか（EtBrはDNAと逆向きに流れるので、低分子DNAのほうからEtBrが抜けてしまいます）いった場合にはこれで解決です。

通常、UV照射装置は感度が最高の短波長と、DNAへのダメージが少なく切り出しに適した長波長の切り替えがついています。長波長に切り替わっているとバンドの蛍光強度は低くなります。そうなっていないでしょうか。

＞この発光の濃淡はＤＮＡ濃度とも関係してくるのでしょうか？わかりにくい質問ですみません。よろしくお願いします。

EtBrの染色強度でDNAの定量をするくらいですから、DNA量（重量）と蛍光強度には正の相関があります。いつも使っているマーカーも薄いとなると別の原因でしょうけれど。

お礼

ありがとうございます。なるほどと思いました。（知識がなくてすみません）さっそくもう一度やってみます。

回答No.3

sachihappy777

ゲルはいつも作りだめしていらっしゃいますか？
作製して日がたったエチブロ入りゲルの場合、質問者様がおっしゃっているような現象（マーカーまでも発光が薄くなる）が経験上よくあります。
私はゲルを作り直してもう一回泳動しなおします。

お礼

ありがとうございます。確かにうちの研究室では作りだめをしてますね。後輩に聞いたところ新しいのを作ってくれるとのことでした。なので作るように頼んでおきました（笑）（私は作る暇がないといったので）

回答No.1

narupon

サンプルはどうなのかわかりませんが・・・。
今までと同量のDNAマーカーを使用し染まりが薄いなら、エチブロの問題です（薄いのでは？）。
作り直しorエチブロ足しましょう。

あと周りの人にも聞いてみて。
・同じマーカー使った人→はっきりバンドが出たか
・最近エチブロ使った人→染まり具合はどうだったか

何で紫外線照射してるかわかりませんが、その機器は大丈夫ですか？使用法あってますか？今までと同じ設定ですか？
確認してください。

お礼

ありがとうございます。ひさびさにこの操作をやったので何が原因かわからなかったもので、さっそく確認してみます。