電気泳動-失敗原因？

質問

今、あるタンパク質の転写因子の同定実験をしているのですが、
その前段階の実験の、電気泳動がうまく行きません。

80bpのDNA断片をPCRで増やし、確認のために
泳動にかけたところ、今まで3回ほど流したのに、
いつも100bpのところまでしか流れません。
泳動時間は120分と、かなり長く取ってあると思います。Vは120Vです。

考えられる原因がよくわかりません。
アガロースの濃度が高いのか‥
泳動時間が短いのか‥
プライマーがおかしいのか‥
はたまたVの問題でしょうか。
SDSをやる必要はないですよね？

どなたかご意見いただけると嬉しいです。
お願いします。

回答No.1

shimuraushiro · ベストアンサー

DNAが80bp位しかないとアガロースゲルではっきり確かめるのは難しいと思います。アクリルアミドゲル等で流したほうが正確にバンドの位置が確認できると思います。

補足

え～そうなんですか！！
すみません、勉強不足で。。/(*ε*)

一応アガロースは１０%とかで相当濃くしたんですけど、だめですか？
３００bpのはアガロースでやってるので、
８０bpをＳＤＳでやってもいいんですかね？
なるべく同じ方法でやったほうが良いのでは‥
と思いましたが、いかがでしょう？？

回答No.3

MIYD

>100bpのところまでしか流れません
表現が気になるのですが、
マーカーはちゃんと分離しているんですよね
(たとえば50bpと100bpなど)
アプライする量が多すぎてバンドが上の方に伸びているということも無いんですよね。

それならば泳動の条件は問題ないはずです。
なれていないのでしたら、PAGEをやる必要もないと思います。

PCRの問題ではないでしょうか。

80bpもあれば、内部に制限酵素サイトがあるでしょうから、
それで切ってみてはいかがでしょうか。
2種類も試せば十分だと思います。
丁寧にやるのならば、そのバンドをクローニングして読んでみてもいいかもしれません。
テンプレートがおかしくて、その長さになっているかもしれません。

無いとは思いますが、ポリメラーゼが結合している可能性を否定するために、
精製してから流してみてもいいかもしれませんが、
多分必要ないと思います。

80bpだったらオリゴを発注してアニールさせた方が早いような気もします。

お礼

遅くなりまして、申し訳ないです！

そして、今回の実験ではREsiteが含まれているのを忘れていました！！
それがちょうど20bp分くらいなので、
80bpのを流して100bpに出て当然でした‥

大変申し訳ないですペコリ(o_ _)ｏ))
これからはもう少し慎重にやります‥
ありがとうございました！

回答No.2

shimuraushiro

１０％のアガロースゲルって作れるんですか？私はやったことないんですが。PCRでバンドは１つしかなかったのでしょうか？もしそうだとてもアガロースだとプライマーダイマーとの区別も一苦労です。

80bpならポリアクリルアミドによる泳動が確実です。SDSは必要なしです。

参考URL：

http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%83%9D%E3%83%AA%E3%82%A2%E3%82%AF%E3%83%AA%E3%83%AB%E3%82%A2%E3%83%9F%E3%83%89%E3%82%B2%

補足

無理矢理作りました笑
溶かすのに苦労しました‥(先輩が)

１つ‥しかないですね、多分‥
温度条件を４つくらい変えたやつを同時に流しましたが、全て100bpのとこに出ました。バンド‥。

あ、PAGEですね(^o^;
本当に勉強不足で申し訳ないです/(*ε*)