ウエスタンブロットで・・

質問

基本的な事の質問なのですが、まずSDS-PAGEで電気泳動する前に、私はサンプルを熱処理（お湯で溶かす）します。例えば免沈したサンプルをー２０℃で冷凍保存したものを溶かすとき。

サンプル中の蛋白はSDSで変性させてると思うのですが、さきほど言ったお湯で溶かす過程で後輩に
「お湯で溶かす事によって変性するんですか？」とか「熱いお湯で溶かして蛋白が変性するのは問題ないんですか」と聞かれました。

私も未熟者なので「・・・。」となってしまったのですが、その基本的な質問された部分を教えていただきたいです。SDSで変性させるのと熱変性する違いはあるのでしょうか？
よろしくお願いします。

回答No.2

pi3-kinase · ベストアンサー

こんにちは。僭越ながら答えさせていただきます。

SDS-PAGEのサンプルを作るとき、多くの場合ボイルしますよね。これは加熱によって水素結合等の、タンパク質高次構造維持に必要な結合を壊し、かつSDSによるタンパク質の変性を促進するためです。また、DTTや2-MEのような還元剤によるジスルフィド結合の還元反応を促進する効果もあると考えられます。実際は、ボイルじゃなくても60℃で5分とかでも大丈夫らしいですし、＃１さんがおっしゃるように熱処理によってかえって悪影響がでるタンパク質もあります。そういう場合は37℃で長時間変性させたり、4℃で1日といった方法もどこかで拝見したことがあります(もちろん、プロテアーゼ阻害にちゃんと留意して、ですが)。
　注意点として、特にタンパク質濃度が濃いサンプルや長期保存しているサンプルなどでは、還元剤が酸化されてしまい、その効力が低下し、その結果、バンドがスメアになったりすることがあります。私の場合は、あらかじめ、SDSサンプルバッファーの濃度が2倍になるようにサンプルを作製し、SDSや還元剤がより過剰になるようにします。これで、バンドがシャープになりました。
　後輩は、今回のように突拍子もない質問を浴びせたりします。これは自分にとっても非常にいい勉強の種になると思いますので、調べて自分の言葉で説明してあげてください。そうすれば、後輩はあなたについてくると思いますよ。あなた自身も、もの知りな先輩に魅かれた経験があるはずです。参考になったかどうかはわかりませんが、がんばってください。

お礼

詳しい説明ありがとうございます。
知識があまりないので基本的な事が分からないところがあるので自分で調べておっしゃる文章をよく読んでみます。
人に教えると突拍子もない事を聞いてくるというのは本当にそうだな～と思います。また、その質問には自分が分からないことたくさん含まれてるので逆に勉強させられます。
もともと自分の専門でない分野に勤めてしまったので知識がほとんどなく自分も勉強中です。
ありがとうございました！

回答No.4

tween20

うちの研究室もものすごく貧乏です。ｗ

いつもどきどきしながらこの試薬足りるかな～～と思いながら実験してます。あはは

すでに既出ですが、SDSはタンパク質を変性させるために入れているものです。1本の鎖にタンパク質を変性させるわけです。負電荷をもつSDSが一定に結合するので分子ごとの荷電量がタンパク質の分子量に比例して移動度に現れるんですね。

私も最初、熱を加える＝プロテアーゼの効果？のようになんだか大丈夫かなぁと思ってましたが
実際はプロテアーゼと違って分解するわけでもないのですね。
熱処理をするのはSDSでの変性を十分に進めるためですね。
これも既出ですが、塩基性、酸性、糖タンパク質ではSDSのつき方に違いがでます。
正確タンパク1ｇにSDS1.4ｇつけたいなら遠心で沈降させるなどもやってみてください～～。

お礼

回答ありがとうございます。
皆さんの回答を参考にして勉強させていただきます！

回答No.3

dadachan

とてもよい体験をされましたね。
私はPh.Dを持っているのですが、非常に貧乏な教室で取りました。
おかげで、今巷に出回っているkitなるものを使った事がありませんでした。
そうすると、原理から全て自分で調べなくてはならず、ものすごく苦労しました。
先生は『論文は実験しながら読むものだ』という先生で、ゆっくり座って調べる事も出来ずに・・・
でも、自分が手がけた実験の全ての原理を知ったために、トラブルがあった時にさまざまな対処法を考え付くことができるようになりました。
そういう経験から、物事の原理を知った上で実験を進めるという習慣を付けていってください。
ちなみに一緒に仕事をしてる某T大の博士は、論文を1報も出してないのに博士号をもらってます。だからでしょうね、物事の原理は全く分かっていません。
そういう意味では、貧乏大学出たけれども勝ち組なのかな?

お礼

始めから便利なものを使ってしまうと慣れてしまって根底から理解してないから適応力も劣りますよね。
ありがとうございました！

回答No.1

ga111

蛋白は千差万別です。

多くは、ＳＤＳが充分くっついてるので、その後の熱処理はあまり関係ないでしょう。「熱いお湯で溶かして蛋白が変性する」といってもそのまえにＳＤＳですごく変性しているということ。

ただし、疎水性の高い蛋白は、熱処理で移動度が異常になったりするので、わざと熱処理をしないこと「も」あります。

ＳＤＳですごく変性していても、保存中になぜか分解が進む蛋白もあったりします。

よって、自分の使う蛋白については、熱処理、保存でどうなるか？　よくチェックしておくことがいいです。（変わらない場合が多いですが。）

お礼

熱処理は関係ないのですね。また、蛋白の種類によって違うというのも勉強になりました。
ありがとうございました。