電気泳動について

質問

電気泳動について
電気泳動(SDS-PAGE)を用いて、タンパク質をバンドとして出現させた際に、近くのバンド同士が接近しすぎていて、あいまいになってしまった際に、そのあいまいになってしまっている個所のゲルを切り出して、再度SDS-PAGEをすることは可能でしょうか。
また、どのようにして一度ゲルの中にバンドとして出現したタンパクを抽出？精製？するのでしょうか。

語彙の使い方等で、不適切な箇所があるかもしれませんが、ご存知の方、ご回答よろしくお願いします。

回答No.3

teru-arai · ベストアンサー

＞どのようにして一度ゲルの中にバンドとして出現したタンパクを抽出？精製？するのでしょうか。

これは染色法によります。銀染色などだとたぶん無理です。
酢酸酸性中でCBB染色なら、切り出したバンドをもう一度泳動するときのサンプルバッファー（pH 6.8Tris/HCl,他）に平衡化するまでつけて（時間は切り出したゲル片の大きさ次第）もう一度クシ穴に押し込めば（少しゲルを砕くと押し込みやすい）OK です。電圧をかければタンパク質はゲルから勝手に出て、スタッキングゲルに入っていきます。

＞近くのバンド同士が接近しすぎていて、あいまいになってしまった際に、そのあいまいになってしまっている個所のゲルを切り出して、再度SDS-PAGEをすることは可能でしょうか。

分子量が接近している、つまり泳動位置がほとんど重なっているタンパク質を分離するにはどうするかということですね。
易しくて確実なのはゲルを長くすることです。長さ８ｃｍ位のゲル板を使っていますかね？　長さ１６ｃｍとか３０ｃｍとかのゲル作れませんか？　それで泳動すれば努力しないで解決します。
大きなガラス板がないときは、うまくいくかどうかはやってみないと分かりませんが、色々試すしかありません。他の方が言われている２次元電気泳動などもあります。普通は、等電点電気泳動を先にしますが、SDS電気泳動をやってから等電点も可能です。上と同様に切り出したゲルをそのまま２次元電気泳動用の時の１次元目のサンプルバッファー（SDSが先の時は6M尿素は必須、でTritonもあった方がよい）で平衡化してから、等電点電気泳動を行います。タンパク質は上と同様に勝手にゲルから出て行きます。
SDS電気泳動の変法を使う。例えばゲルに尿素（６Mとか）を加えておくと泳動位置が変化することがあります。

お礼

詳しい回答をありがとうございました。
ゲル板の長さを長くしてみます。
また、タンパク質の抽出方法を教えていただき、ありがとうございました。

回答No.2

ga111

可能ですが、普通は2次元の電気泳動を行います。
再度SDS-PAGEしなくても、解像度が高いため、2回やっても効果が薄いからです。

＞また、どのようにして一度ゲルの中にバンドとして出現したタンパクを抽出？精製？するのでしょうか。
バンドを切り出し、透析チューブに入れて、電場をかけて溶出できたりします。

ものによっては、ぎりぎりまで長く流すだけでいい場合もあります。

お礼

ご回答ありがとうございます。

二次元電気泳動を試してみたいと思います。
それから、タンパク質の溶出方法を教えていただき、ありがとうございました。

回答No.1

otx

同じような分子量のタンパク質であるためにバンドが重なっている、ということでしょうか？
状況がよくわからないので、次の点について明確にしていただければ、アドバイスしやすいです。

何を証明したくて実験をしているのでしょうか？
「あいまい」とは具体的にどういう状況のことを指すのでしょうか？

お礼

説明不足で申し訳ありませんでした。
ご回答ありがとうございました。

補足

回答ありがとうございます。
分子量が似ているということで合っています。

目的ですが、未知のタンパク質がバンドとして現れた際に、そのバンドが複数のタンパクから構成されていたら、どのタンパクであるのかを特定できないのではないかと思ったので、「あいまい」ではいけないのかなぁと考えました。

無知で申し訳ないのですが、再度よろしくお願いします。