SDS-PAGEゲルのトラブル

質問

あるタンパク質を生体物質から私の研究室（かなり小規模な研究室なので聞ける人があまりいないのです。）では精製していて、随分以前からそのタンパク質が精製できているかどうかをSDS-PAGEゲル上で確認していました。

ところが、ここ1ヶ月ほど前からそのSDSーPAGEゲルの電気泳動結果がおかしいのです。。

例えば、
*本来あるはずの低分子タンパク質のバンドが薄くしか（もしくは全く）見えない。高分子領域にスメアがたくさん見える。
*本来サンプルがアプライされているはずのないレーンにスメアっぽいバンドがたくさん見える。（特に高分子領域に）
*バンドはかなりスメアっぽく見える。（シャープなバンドではない。）

あと気づいたことですが、泳動直後のゲルはかなり暖かくなっていました。

このような原因として何が考えられるでしょうか？本当に困っています。

ちなみに、私たちの研究室では、
*SDS-PAGEゲルは自作
ポリアクリルアミド、SDS等を水溶液にしたものが冷蔵庫にストックされていて（2.3ヶ月前に作られました）、その水溶液と常時調製している10％APS溶液そしてTEMDを混ぜ合わせて常に作っています。
*ローディングバッファー
半年ちょっと前に作られて冷蔵庫にストックされたものを使っています。
*泳動用バッファー
10倍のTrisベースのバッファーが常温でストックされているので、それを随時希釈して使っています。
*泳動条件
150V（電気泳動ユニットに異常は見られません。）

回答No.3

kgu-2

私も、試薬を作り直します。冷蔵庫にいれていても、長時間入れていると、カビは生えます。
　すなわち、微生物が死滅するわけではないので、長期間保存すると、溶液中に生き残っていたものが増殖し、そこからタンパクが分泌されて・・・というのが推定されます。

　それより気になったのは、
>随分以前からそのタンパク質が精製できているかどうかをSDS-PAGEゲル上で確認していました
これは、SDSの入っていない条件で、精製した物が単一のバントでチェックするのが普通でしょう。
　SDS-PAGEでは、分子量は同一でも、電気的な性質によって異なるタンパクのチェックはできていないハズデス。

回答No.2

MIYD

No.1さんの全部作り直したほうがいいというのが一番ですが、

*本来あるはずの～
と
*本来サンプルがあぷらいされているはずのない～
のスメアの位置は同じなのでしょうか。

後者のスメアはバッファーか泳動層か
ウェル(コームを抜いた後に洗ってますか？)
が汚いことが原因じゃないかと思っています。

10%SDS水溶液を冷蔵保存している研究室は少ないと思いますが、
毎回析出しているSDSを溶かしてから使っていますか。
誰かが溶ける前のものを使ってしまったのならば、
その後で全部溶かすと濃度が濃くなっているかもしれません。

精製過程のプロテアーゼのコンタミやプロテアーゼインヒビターのストック溶液の濃度やロットの微妙な違い、
バッファー、塩濃度の微妙な違い
冷蔵庫を誰かが開けっ放しにして温度が上がってしまった。
など、先輩のときと同じ組成、条件のサンプルとはいえません。
特に精製をしているのでしたら、
サンプルが前と同じかどうかには十分に注意が必要です。

先輩と同じ操作を自分がしているから起こらないという考え方には無理があると思います。

回答No.1

trans55ketolase9

こんにちは。

１）悩むよりもまず、ゲル作成用試薬、特にアクリルアミド溶液とサンプルバッファーを新しく調製しなおして見る。
２）分子量既知の標準試料、マーカー、ＢＳＡのみ、などを流し、キレイな泳動像が見られるか、分子量は合うかなどチェックする。
以上のことで標準タンパクの泳動に問題無いのならば、精製試料の問題と考えられます。

保存は何℃ですか？分解は考えられませんか？
アグリゲーションは無いですか？

補足

明日アクリルアミド溶液とサンプルバッファーを作り直してもう一度やってみようと思っていたところでした。本当にそうですよね。。

分子量既知の標準試料、マーカーのみを流すというのもやってみたいと思います。

＞保存は何℃ですか？分解は考えられませんか？
アグリゲーションは無いですか？

タンパク質試料の保存は４℃で行っています。過去に先輩が同じ方法でその試料を扱っていてうまく行っていたので分解や凝集しているとは考えがたいです。

泳動バッファーにもしかしたら問題があるのかも？とも思ったりもしております。

私の研究室にあったプロトコールによると10倍濃縮泳動バッファーは精製水にグリシン、Tris、SDSを入れて、HClでPH8.3に合わせてつくるとあるのですが、ネットのあるページには泳動バッファーのPHをHCｌ等で調製するとイオン濃度がおかしくなって泳動パターンがおかしくなることがあるとかいてあったのですが。。。