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※ ChatGPTを利用し、要約された質問です（原文：Restriction Enzyme）
What could be the reason for obtaining a mixed sequence in an inserted DNA fragment?
このQ&Aのポイント
- You have isolated a fragment using EcoR1 restriction enzyme and are inserting it into a plasmid with a single EcoR1 restriction cleavage site. Despite showing that only one copy of the fragment is inserted per plasmid, you find a mixed sequence in the insert. What could be the reason for this?
- In the given scenario, the expected sequence is obtained for the regions on either side of the inserted fragment in the plasmid. However, the sequence of the insert itself shows a mixture at each position. What explanation can be given for this unexpected result?
- When sequencing the plasmid region around the inserted fragment and the fragment itself, the expected sequence is obtained for the regions on either side of the insert. However, the sequence of the insert shows a mixture at each position. What could have caused this unexpected result?
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既に回答が他の方からなされていますが・・。 シークエンスに使ったプラスミドが均一でなく２種類の混ざり物だった、それぞれのプラスミドにはクローンした断片が逆向きに入っていた、というのが答えだと思います。 この実験ではある断片をプラスミドに EcoRI を使ってクローニングしています。問題文より断片が一つだけ入っていることは確認されています。しかし、断片の両端は同じ EcoRI 部位なので、プラスミドに順・逆の２方向で入り得ます。この向きの確認はなされていないようです。 どうやらこの実験では順、逆両方向のプラスミドの混じり物をシークエンスのテンプレートとしたつかったようです。この場合、得られる配列はプラスミド部分は単一のきれいなものですが、断片部は２つの配列の混じり物になります（これが mixture の意味でしょう）。 使ったプラスミド（の混じり物）を再度大腸菌に入れ、シングルコロニーを拾って純化することが必要です。そうすれば向きが統一されますから、解釈可能な配列情報が得られます。
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- owata-www
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回答No.1
＞DNA MoleculeがEcoR1 restriction cleavage siteを２個もっていたためとか… まあ、方向性としては合ってます。 つまる所、逆に入ったってことです↓
