インサートDNAにNdeIサイトがある場合

質問

大腸菌でタンパク質を発現させるため、pET21aをテンプレートに発現ベクターを作製します。
その際、NdeI/BamIサイトに目的遺伝子を導入しようと考えていたのですが、インサートDNAのど真ん中にNdeIサイトがありました。
Promoterおよびrbsと開始コドンの距離は重要であると考えられるため、
1. NdeI以外の制限酵素サイトに目的遺伝子を導入
2. Inverse PCRにより開始コドンの位置を調整
といった手法で発現ベクターを作製しようと考えているのですが、この方法に問題はあるでしょうか？
また他に簡便な方法などはあるのでしょうか？

回答No.2

Dr_Hyper

NdeI -----NdeI---- - BamHI のフラグメントって事ですよね？

cDNAの外側でlinker PCR NdeI　とBamHIを付けておく。
insertをNdeI BamHIで切る。

NdeI-NdeIとNdeI-BamHIのフラグメントができるので、別々にゲルから切り出して精製

まずNdeI-BamHIのフラグメントを入れる。
mini prepでinsertが入っていることを確認。本来より短いfragmentなのでsequenceで確認しやすのでこの時点でvectorのprimerをつかって配列を確認しておく

そのあと、そのplasmidにNdeI-NdeIのフラグメントを入れる。
T7 primerで正しい向きに入っているかを確認。あらかじめ酵素サイトで向きが確認できるものがあればそれで選定しておく。
最初のNdeI-BamHIのフラグメント（N末欠失）がinframeならば、それをN末欠損の変異体として同時にタンパクを作っておくこともできるし、有用。詰めて実験を行えば1週間いないに完成。

むろん、fragmentができた時点で3分子ligationも可能。
効率は悪い。

回答No.1

yuklamho

1. NdeI以外の制限酵素サイトに目的遺伝子を導入
2. Inverse PCRにより開始コドンの位置を調整
といった手法で発現ベクターを作製しようと考えているのですが、この方法に問題はあるでしょうか？

適当なサイトが見つかれば、もしくは作れれば１の方法で良いと思います。私はどちらかというと素人なので、２の方法は良く分りません。
私だったら、最初にNde Iでインサートを切り出して、それからBamH Iで残りのインサートを切り出します。そして、NdeI-BamHIの断片をベクターにサブクローニングしてから残りのNdeI- NdeIの断片をサブクローニング（この場合、両方向に入るので欲しいクローンが得られる確率は50％？）すると思います。