KOD-Plus-を用いたPCR

質問

KOD-Plus-を用いて4.6kbのゲノム領域を増幅し、ベクターに挿入しようとしています。しかしながら、思うように産物が増えてくれません。アガロース電気泳動で確認すると、エキストラバンドが出たり、時には全く増幅がおこっていなかったりします。条件を検討し、Mg濃度をかえてみたり、アニーリング時の温度を下げてみたりしましたが、いい効果は得られませんでした。何かいい方法をお持ちの方いらっしゃいましたら、アドバイスお願いします。
ちなみに、リバースプライマーにはMycタグをつけています。

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

以前、私がアドバイスした件に関わりがあるようで、責任を感じてしまいました。

私なら、まず迷わず酵素を変えます。KODはエラーが少ないとされていますが、増幅力はやはりTaqに劣ります。増えないのではしょうがないですから、低エラー性は少々犠牲にしても、TAKARAのExやRocheのHiFiなど、Taqをベースにしてproof-reading活性を持たせた酵素を試してみてはいかがでしょう。増えは良いですし、それほどエラーがバンバンはいるということもないです。KODでもエラーが入るときは入りますので程度の問題です。
（そういえば、最近業者さんがTaqより伸長性がよくて、KODよりエラーが少ないPhusionという酵素のパンフをおいていったのですが、どんなもんでしょう）。

あとは、バンドが見えなくても、そのPCR産物を少量取って、もう一度PCRをかけるというのも手だと思います。
Mycタグのために長いプライマーになっていると思いますが、2回目にPCRをかけるときには、目的とする産物を増やすような、通常の長さのプライマーにできるとなお良いと思いますが（Myc配列がリピートしている場合デザインが難しいかもしれませんが）。

お礼

いつも丁寧なご回答ありがとうございます。
fidelityが高いという点で、KOD-plus-を使用してみたのですが、普段のタグがついていないようなプライマーを使う時はちゃんと増幅しているので、大丈夫だと思ってました。stepdwon PCRなどを検討していたのですが、酵素自体をかえた方がよさそうですね。早速、TaKaRa Ex Taqを用いて、PCRを再開します。

回答No.2

MIYD

私は長い配列は試していませんが、
増えはいいですよ。>phusion
ただfidelitgyについてはエラーが入るときは入るので、
過信は禁物です。

genomicでその長さでしたらLA-taq(with GC buffer)をお勧めします。
LAは普通のbufferもありますが、GCのIをはじめから使ったほうが条件検討の時間が減っていいような気がします。
前に1.8kbをクローニングした時には1回で当たりのクローンが取れて、読んだ3クローンについては変異は入っていませんでした。

エクストラなバンドが出ていても目的のバンドが増えているのでしたら、
ゲルから切り出すことは出来ないのでしょうか。
目的のバンドの位置をチップでつついたもので2回目のPCRをかけるという方法もあります。

お礼

いつもご回答下さり、ありがとうございます。
LA-Taqは今間でのところ使用したことがなかったので、増幅率やfidelityがどれほどのものか分からなかったのですが、増幅率、fidelityの点でもよさそうですね。是非チャレンジしてみたいと思います。
ゲル抽という手はやってみたのですが、バンドが非常に薄かったので、紫外線を照射してもバンドの輪郭がぼやけてしまい、結局どこにあるか分かりませんでした。その後も、ゲル抽でバンドを拾い出したのですが、シークエンスの結果、配列がめちゃめちゃでしたた。なので、ゲル抽は無理でも、２回目のPCRにかけるという手はありだと思います。