植物の in situ ハイブリダイゼーション

質問

実験で植物のin situ hybridizationを試みています。
しかし、なかなかうまくいかず、発色が確認できません。

経験者の方で、「ここは気をつけろ」みたいな注意点やアドバイスがあれば、
お聞きしたいのですが、よろしくお願いします。

材料はタバコで、標識にはDIGを用いています。

回答No.1

yowakiti · ベストアンサー

おお、なつかしい。

10年弱と遠い昔に大学でInSituやってました。
就職と同時に、研究職から離れましたので、ほとんど忘れてしまいましたが。(笑)
技術や道具もいろいろ進歩しているのでしょうね。
私は電子顕微鏡での観察時のみInSituをやってましたので、発色？は金コロイド、標識はBrdU（だったかな？）でやってました。材料はクロレラでした。

苦労したのは、
１．試料の樹脂中への固定時の脱水（エタノールへの置換)、樹脂への置換の条件。
－急ぎすぎると細胞壁以外の部分が直径で半分くらいに縮んでしまい、目玉焼きのような状態になってました。蛍光顕微鏡下ではよくわかりませんが、電顕下では良くわかります。程度がひどいとまったくターゲットを捕まえることが出来ません。
－ゆっくりしすぎると、膜構造が溶けてしまうのか、細胞内が均一に混ざってしまい、やはりつかまりません。
２．ブロッキング、洗いの条件
いろんなブロッキングエージェント、それぞれの混合を試した記憶があり、その差に驚いた記憶が残っています。洗いの条件もいろいろ試した記憶が残っています。

基本的な方法は、以下の論文及びその孫引きが参考になるんでないかと思いますが、私は読んでません。（著者の一人に直接習いましたので。)

Saito C, Hayashi M, Sakai A, Fujie M, Kuroiwa H, Kuroiwa T. Related Articles, Links
Improved sensitivity for high resolution in situ hybridization using resin extraction of methyl methacrylate embedded material.
Biotech Histochem. 1999 Jan;74(1):40-8.
PMID: 10190260 [PubMed - indexed for MEDLINE]

私は、試料の作成、反応条件の設定など、目的のものを吊り上げれるようになるまで1年くらいかかりました。少し、投げやりになっていた部分もありますので、今考えるともう少し早く出来てただろうなと思いますが。

それでは、ぐっどらっく！

お礼

気づくの遅れて、御礼が遅くなり申し訳ありません。
回答ありがとうございます。
1年もかかったのですか。根気ですね。
論文参考にしてがんばってみます。