in situ hybridizationのFISHはなぜDNA?

質問

分子生物学の初心者です。
ISHこれからやろうと思っているのですが、なぜFISHはDNA推奨なのでしょうか？
またFISHでもRNAで行うことは可能なのでしょうか？

よろしくお願いします。

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

>またFISHでもRNAで行うことは可能なのでしょうか？
プローブを直接蛍光ラベルして組織中のRNAに対するISHをやっている例は知りません。RNAは高々数kb、それをそれより短いプローブで検出するのですから、ターゲットあたりの標識数は限られますので、おそらく検出感度が不足です。少ない標識を酵素反応で増幅する必要があります。

旧アマシャムだったかで、プローブをFITCラベルしてアルカリフォスファターゼ (AP)標識抗FITC抗体で検出するシステムがありました。FITCのみだとプローブの合成効率を推定する程度の感度しかなく、本番の検出は酵素反応で増幅したシグナルを見なければなりませんでした。

AP標識を蛍光で検出するためのAP基質(HNPP)がロシュから出ています。蛍光検出したいのであればそれを使うと良いでしょう。

＞なぜFISHはDNA推奨なのでしょうか？

DNAといっても染色体上の1コピーを検出するわけですね。
この場合、コスミドなどの巨大なプローブを使えば、標識数は稼げますから、酵素による増幅なしで直接蛍光標識を検出することも不可能ではありません。また、高倍率で観察して、染色体上という微細な構造上の一点のシグナルを検出するので、蛍光標識はそれほどたくさん必要というわけでもないのでしょう。

ピンポイントのマッピングを目的としているような場合、酵素で増幅してしまうと解像度が落ちてうまくない場合もあるでしょう。

お礼

なるほどぉ。。
プローブの長さが問題だったのですね！
大変よくわかりました。ありがとうございます。