たんぱく質の実験方法

質問

今大学の宿題をやってるんですが、図書館で調べてもわからない問題があり困ってます。

一つ目は、アルカリ性ホスファターゼの四次構造のホモダイマー（同一サブユニットの二個会合体）を確認する実験方法を考えよ。

二つ目は、たんぱく質の構造変化が二状態で変化の過程で中間体が存在しないことを確認する実験方法を考えよ。

どちらも実験方法を考えよという問題なんですが、自分の知識レベルではさっぱり思いつきません。どなたかわかる方がいましたらご教授お願いします。

回答No.1

p0ntakun · ベストアンサー

ちわーっす！
困ってるみたいだね。

こういう時は泳動すればいいよ。
でも、SDS-PAGEだとバンドが1本しか検出できないよね？

だったらNative-PAGE（SDS＆メルカプトエタノールを使わないSDS-PAGE）はどうかな？
タンパク質を変性させないまま泳動できるよ♪
おおまかな方法を教えるね。

1）
　泳動バッファとサンプル調整バッファの組成はSDS-PAGEと同じ（ただし、SDS＆メルカプトエタノールは抜き）。

2）
　泳動サンプル調製で熱処理せずに泳動。（熱でタンパク質が変しちゃうから）

アルカリ性ホスファターゼは100％の分子がダイマーを形成しているわけじゃないと思う。（めっちゃピュアに精製したものだと話は変わってくるけど）
きっと中には一匹狼のモノマー君もいるはずだよ。
変性させずに泳動すれば太いバンド（ダイマー）と細いバンド（モノマー）の2本が検出される。（このケースではダイマーの量が多いので太いバンドとして検出）

えっ？
もし、「超激ピュアな酵素だったら」って？
ダイマーを中途半端にモノマーに戻せば、バンドは2本検出されないかな？
メルカプトエタノール（SーS結合をカットする試薬。システイン残基の酸化防止剤）の濃度の異なるサンプル（特濃～中辛～無添加）を複数用意して泳動すれば、2本出るよ。

あと、HPLCで分析しても良いと思うよ。

「二状態の中間体」はよくわかんないから、お友達に聞いてね。
ではでは、良い夏休みを！

お礼

丁寧な回答ありがとうございます。
もう宿題は提出したんですが、自分も一応電気泳動を使う方法をかきました。ただ、ここまでは詳しく書けませんでした。タンパク質を変性させないで済む方法があるんですね。勉強になりました。