タンパク質抽出方法

質問

植物体からのタンパク質抽出方法について質問です。

茎が直径5mm－10mmほどのタバコ植物から、タンパク質を抽出する方法について質問です。
現在、葉や茎について、それぞれ鋏で切断して、50mlチューブに入れ液体窒素で凍結破砕し、タンパク抽出、という工程で実験を行っているのですが、茎が堅くてなかなか破砕できません。

植物体からのタンパク抽出方法について、効率の良い方法などがあれば、ご助言をよろしくお願い致します。

回答No.6

Amakosan

>サンプルごとの使用器具の洗浄をD.W.のみで洗浄している、ということなのでしょうか。
洗浄に関しては、（ポリトロン刃の洗浄は）うちではD.W.のみでした。
試験の目的、求められる精度次第で洗浄の方法も違ってくるとは思いますが。
（たとえば、RNAサンプルを抽出する場合は乳鉢をsonication→D.W.洗浄した後でアルミホイルに包んで
乾熱滅菌して、サンプル数だけ準備しますよね？）

>ワイパーとは、何か洗浄用の試薬のことなのでしょう
これはキムワイプ、サービスタオル等のことです。

回答No.5

lamb1204

>とありますが、「Chl.を除く」のChl.とは何の略なのでしょうか。
よろしくお願いいたします。

これは失礼しました。クロロフィルです。
まぁ、落とせなくなっても色が付いているだけって思われるかもしれませんが、それが影響する解析もあるかも知れませんから。
器具の洗浄は実験の基本であり、また実験をどれだけ理解しているかが顕れるところでもあります。

回答No.4

lamb1204

>検体を乳鉢で磨砕
>↓
>乳鉢をエタノールで拭き取り
>↓
>次の検体を乳鉢で磨砕
>↓
>乳鉢をエタノールで拭き取り

エタノールで拭くだけというのは、
ちょっと不安な気がします。
私の研究室は、その辺をとても気を使うので、
乳鉢は、可能な限りサンプルの数だけ用意し、
1回使用した後は、エタノールでChl.を除いて軽くすすいだ後に超音波洗浄してから、普通に洗剤で洗っています。
超音波はしないとしても、せめて洗剤での洗浄はしたほうがいいのではないでしょうか？

お礼

lamb1204さん
ご返信ありがとうございます。

>1回使用した後は、エタノールでChl.を除いて
とありますが、「Chl.を除く」のChl.とは何の略なのでしょうか。
よろしくお願いいたします。

回答No.3

Amakosan

私が使っておりました方法ですが、連続でサンプルを処理する場合は、D.W.を入れた1リットルビーカを3つほど横に置いておき、

・ワイパーでポリトロンの刃を拭取り
↓
・D.W.中でポリトロン刃を回し洗う
（3つのビーカで順に行う）
↓
・ワイパーで水分を拭取り
といった感じです。

当然、数サンプルごとに洗浄用の水は取替えます。

刃の隙間に繊維質が詰まることがよくありますので、取り除くために小さめの先曲ピンセットを準備しておくと、なお良しです。

お礼

Amakosanさん

ご返信ありがとうございます。

Amakosanさんは、数サンプルを分析する際に
サンプルごとの使用器具の洗浄をD.W.のみで洗浄している、ということなのでしょうか。ワイパーとは、何か洗浄用の試薬のことなのでしょうか。
よろしくお願いいたします。

回答No.2

lamb1204

タバコは磨砕したこと無いですが、イネをやっているので。イネは、地味にすごく硬い植物なんで参考になるかと。

１．通常の磨砕
磨砕には乳鉢を用います。乳鉢中で、解けないようにLN2を加えながら、完全に粉末になるまで凍結粉砕します。その後、緩衝液および新鮮重の0.3倍量の石英砂を加え、繊維質が目で見えなくなるまでがんばって磨砕します。（加えたときに緩衝液が凍結しないタイミングが難しければ、氷上の新しい乳鉢に粉砕した試料を移します。）比較的硬い器官でも１５～２０分がんばって磨砕すると何とかなります。

２．非常に硬い器官の磨砕
イネで最も硬い完熟粒（要は籾殻つきの米）は、いきなり乳鉢で粉砕するのは困難です。
昔は、丈夫なプラスチックバック中でLN2凍結させた粒をかなづちで叩き壊した後、１と同様にしていました。現在では、非常に粉砕効率の良い機械が出ているので、粉砕の難しい試料はそれを用いています（マルチビーズショッカー、安井）。ただし、粉砕試料を全て回収するのが難しいので、データを新鮮重ベースで評価する場合には工夫が必要になります。

お礼

lamb1204さん

ご助言ありがとうございます。
乳鉢で磨砕試してみます。
何分初心者で、基本的な質問で申し訳ないのですが、
多検体を乳鉢で磨砕する場合、1検体毎エタノールで拭き取れば、それぞれ検体毎のタンパク質についてコンタミの可能性は心配ないでしょうか。

検体を乳鉢で磨砕
↓
乳鉢をエタノールで拭き取り
↓
次の検体を乳鉢で磨砕
↓
乳鉢をエタノールで拭き取り…とこのような方法で大丈夫なのでしょうか。

回答No.1

Amakosan

protease inhibitorを加えたバッファに入れ、polytronで破砕するとよいかと思います。
参考URLにポリトロンカタログを貼っておきましたのでご参照下さい。

参考URL：

http://www.ilw.co.jp/mainpage/macine/homogenize/homog-main.html

お礼

Amakosan

ご回答ありがとうございます。
ホモジナイザーを使用して破砕してらっしゃるのですね、
質問なのですが、多検体を破砕する場合、
先端の洗浄は、どのようにしているのでしょうか。

次の検体に移るときにタンパク質のコンタミがない様に洗浄するのは、
エタノールで拭き取る程度で大丈夫なのでしょうか。

よろしくお願いいたします。