primer設計

質問

ヒトでは配列が分かっているがブタでは分かっていない遺伝子でPCRを行いたいです。
ヒトの配列からプライマーをPrimer3で設計しPCRを行ったのですが、欲しいバンドがでません。
変性は最初95℃5分サイクル内は1分、アニーリング温度は50℃から62℃まで3℃毎で1分、伸長は72℃1分（全て1kb以下なので）、最後に72℃10分です。
Forward6本、Reverse6本設計して組み合わせて試しました。
結果、どの組み合わせでも目的の大きさのバンドがでていませんでした。
何か工夫する点があれば教えていただけたらと思います。
時間の都合もあり、委託できたらとも考えているのですが、配列が類似していると言われている他種（ヒト）では分かっていても目的とする種（ブタ）で配列が分かっていない遺伝子では委託で作ってもらうことは出来ないでしょうか？？

回答No.1

otx · ベストアンサー

いくら条件をあげたところでprimerの配列がどのようになっているかわからないと何とも言いようがないです。

ちなみに、私は最低42℃でアニーリングさせたことがあります。
それでうまくいったことがありました。

なぜ50℃と下限を決めたのかわかりませんが、気持ちはわかります。

後、ある動物ではわかっていない遺伝子でも、他の複数の動物で明らかになっている遺伝子の場合、Degenerate primerを使いますが、

今やっているのって、それですよね？

回答No.2

yutamadri

遺伝子（アミノ酸）配列には多生物種に渡って保存されている領域とそうでない領域がありますが、貴プライマーは保存領域を元に設計されているのですか？

ちなみに配列が分かって無いと委託合成は無理だと思います。
クローニングの委託なら可能かも知れませんが。