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ウエスタンのSDS化について
ウエスタンのサンプル作成のSDS化が不十分であることはあるんでしょうか?その場合、そのような影響がでますか。現在は95℃、5分で熱処理しています。 また、免疫沈降法の最終段階で、プロテインアガロースと切り離すのが不十分ということは起こりうるんでしょうか?
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なるほど、定量的にいかないということですね。 何でもいいのですが、例えばIgGを希釈して同じ量を泳動し、westernをしてバンドが均一に検出できますか? あなたの腕を信用しない訳ではないですが、westernで定量的な仕事を行う場合、化学発光の試薬をプロトコール推奨よりも少なく使用した為にはまってしまうことが有ります。たとえばECLなどでは、一枚のメンブレンに数ml使用すると思いますが、普通の研究室で行われているプロトコールでは、ミニゲル一枚のサイズであれば、反応試薬は1 mlで十分と言われます。これは、節約できて一般的には正論ですが、メンブレン一枚を使用して定量的に行う時には基質を十分量メンブレン上に保持しないといけないので、化学発光による定量的な実験に於いては問題が有る時があります。 具体的には、メンブレン上に残るPBSやTBSなどのwash bufferによって少量の化学発光試薬が場所によって希釈されたところと、希釈されなかったところが生じ、見た目では気がつかないムラができることです。これは、試薬をメンブレンに加えた後結構気をつけてまんべんなく揺らさないとなかなか全体にまんべんなく試薬を浸透させることができません。このことが起こっているかどうかは、一度化学発光したメンブレンをもう一度同じように化学発光の試薬で処理し直して、もう一度一回目と同じバンドパターンになるかどうか確認してください。もし単に試薬を節約してしまったために、このようなムラが生じているのであれば、前回のバンドパターンと違ったパターンを示すことがあります。注意としてはこの2回目の処理の時はメンブレンの揺すり方をいつもと変えてみてください。それでもバンドパターンが一回目、二回目同一であれば、IPの時に原因を求めていいと思います。
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- Dr_Hyper
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普通は無いと思います。IPをされて目的にバンドが検出できないのでしょうか。 サンプルバッファーで最も起こりやすいトラブルは、DTTまたはメルカプトエタノールが十分効かずバンドが二本になったり、泳動度がおかしくなったりすることがあげられます。 十分のSDSが入っていて95℃、5分で熱処理でprotein Aから離れないのは、有っても極わずかでは無いでしょうか?western blottingをしてIgGのバンドが検出できないなどの結果をお持ちでしょうか? もう少し詳しい結果があればお力になれるかもしれません。
補足
IgGのバンドは検出されます。目的のバンドも十分検出できます。ただ、IPと同じ抗体でウエスタンをしたバンドにばらつきがあるのです。タンパク量を揃えているのに。