ＧＦＰ融合タンパク質と抗体が反応しません。何か良い方法はないでしょうか？

質問

A：以下に、実験方法を書いたのですが、どこに問題があるのでしょう?
B：ＧＦＰやその関連のタンパク質の融合タンパクを使われた方で抗体と反応しなかったことはありますか？

Aについて、
酵母細胞内で、GFP融合タンパクを発現させて、
蛍光顕微鏡観察で発現を確認しました。
そこで、
・WesternでGFP抗体と反応させてみたましたが、
バンドがでません。
・免疫沈降後SDS-PAGEやって見てもだめでした。
条件を代え、
１：抗体濃度を変えたり、抗体反応も、オーバーナイトにしました。
２：Westernの条件で、PBSをTBSにしたりしました。
３：Westernで使うタンパク抽出方法は「サンプルbufferでボイル溶解」から、
「１：集菌した酵母にサンプルbuffer・プロテアーゼインヒビターを加え、加熱（100度）２：ガラスビーズを加え、ボルテックスで破砕、加熱、３：遠心」に。
抗体は、マウスIgＧを使っています。

B:について、
論文で、ある種のGFPとの融合タンパクはWesternでは
抗体と反応しなかった。
と書いてあったものがあると、人づてに聞きました。
やはりTagをHAやＭyc、Fragに変えたほうが良いのでしょうか?

長々とすみません。書き方が的を得ていないかもしれませんが、教えてください。お願いします。

回答No.3

sfwaesr · ベストアンサー

遅くなってすみません。

>「IB＝ImmunoBlotting」ですか？
そうです。個人的な趣味ですが、僕はWestern blottingよりImmuno...を好みます。厳密には使い分けると思います。

>なぜ「目的のサイズでない」ことも　あるのでしょうか？
タンパク質の持つ等電点（電荷）で泳動度が変わることが時に起きます。塩基性が妙に高いとか、かなり特殊なタンパク質の場合に起きます。
あとは予期しない翻訳後修飾や切断によって大きくなったり小さくなったり。

>「デグ」とは？
デグラデーションの意味でかきました。ごめんなさい。壊れるというつもりでした。

Ureaは8Mを通常用いますが、これで可溶化したサンプルを直接SDS-PAGEにかけると泳動パターンが乱れることがあります。そのときは、希釈したり、沈殿してからやってみてください。
僕は普段は哺乳類細胞を使っているため、特殊な場合（二次元電気泳動の時やタンパク質の個々の性質で必要なとき）を除いては、urea以外の方法で可溶化を行っていますが、酵母ではureaを使うと改選することがよくあります。あと、タンパク質抽出になれていない後輩と一緒に実験をしていたときに、同じことを何回か繰り返させたら急にとれるとうになったこともあります（何が変わったかわかりませんが・・・）。
プロトコールは、何だろう。そこら辺にあるタンパク質のプロトコール本（羊土社の「タンパク質実験ノート」など）でよいと思います。

また、何かありましたら。

お礼

遅くなりましたが、ありがとうございました。
3月末、無事卒論を提出し、卒業いたしました。
結局、取れない原因がわからないまま卒業となってしまいましたが、
答えてくださったみなさん、
特にsfwaesrさんの回答のおかげで、
一人で悩むよりも助かり、自分の実験についてよく考えられたと思います。
現在は、少し違う分野で働いていて、少し落ち着いたのでお礼を言いたく書き込みました。
アドバイスをいただき、思い出ぶかい研究生活を送ることができました。
本当にありがとうございました。

回答No.2

sfwaesr

目的タンパク質を融合していないGFP（GFPのみ）のIBはされましたか？

もし、GFPのみでIBがみられて目的タンパク質をつけたらバンドが検出されないときは融合させたタンパク質の性質です。このときは、Ureaで溶出するなど可溶化の条件が重要です。目的のサイズでないこともあるのでご注意ください。デグっている可能性もあります。

もし、GFPのみでもバンドがみられないときは、抗体または二次抗体、化学発光がおかしい可能性があります。たいてい、GFPのみならバンドがでるはずです。抽出に失敗しているかもしれません。

基本的に蛍光で発色しているのであれば、それなりにポリクロのanti-GFP Abであれば検出できるはずです。

ご参考までに。

補足

ありがとうございます!!!とても参考になりました。

GFP（GFPのみ）の免疫沈降とWesternはやりました。
その結果、ちゃんとGFP：30Kda付近にバンドが出ました。

が、目的タンパクとの融合タンパク質は出ていません。
抗体は書き忘れましたが、マウスモノクロIgGでした。
ちなみに、GFP融合タンパク質の発現量もあまり多くないので、細胞数を増やしたり、抗体量も増やしました。

やはり仰っていたように、「融合させたタンパク質の性質」なのでしょうか？
それならば、それを突き詰めて行きたいのですが。

タンパク質可溶化のサンプルbufferには、DTT,SDS,グリセロール，ブロモフェノールブルーを使ってます。
もしよければ、「Ureaで溶出するなど可溶化の条件」について教えていただけないでしょうか？
今まで、Ureaは使ったことが無いので。本の題名でもかまいません。自分でも探して見たいと思います。

さて、勉強不足で、申し訳ないですか、
・「IB＝ImmunoBlotting」ですか？
・なぜ「目的のサイズでない」ことも　あるのでしょうか？
・「デグ」とは？
すみませんが、よろしくお願いします。

回答No.1

shimuraushiro

理由は分かりませんが、私もGFPの融合タンパクはウエスタンでは抗体で検出できないというのを聞いたことがあります。発現ベクターの構築が面倒かもしれませんが、ウエスタンではお書きになっている通りMyc,HA, Hisなどで検出したほうが良いかもしれません。

お礼

すばやい回答ありがとうございます!!!
やはりそう言う話はあるんですね。

私の研究は３月で終わりなので、
今から発現ベクター構築は時間的に難しそうです。
ただ、今後Tagを変えることになると思います。

どんなタンパク質との融合タンパクか
分かりますでしょうか?
もし分かれば教えてください。
よろしくお願いします。