遺伝子発現でのプロモーターについて

質問

GFPと他の興味ある遺伝子を1つのプラスミドやウイルスで共発現させようと考えています(ク○ーンテック社で出てるのは知ってます)。その場合、SV40とCMVの2種類使ったほうがいいのでしょうか？たとえば、1種類のみで、SV40をそれぞれにつけた場合はあんまりよくない気がしているのですが、どうなのでしょうか？また、こういったプロモーターと遺伝子発現に関する実用的な書籍、Web Site(国内外ともに)を紹介していただけたらと思います。できたら組織特異的な(脳、心筋や骨格筋など)プロモーターに関しても知りたいのですが。かなり未熟ですが、よろしくお願いいたします。

回答No.4

kaazuu

僕の用いているtet-on vectorだと、目的遺伝子はCMVで
抗生物質耐性遺伝子は、SV40です。
プロモーターのそれぞれの強度を少し調べてみたらいかがでしょう。僕はどっちがつよいか知らないのですが。
たぶん、同じくらいの強度ではなかろうか、と思うのですが。イメージ的には、ウイルスプロモーターを活性化させる転写因子がcompetitionしそうなきがするのですが。気のせいかもしれませんが。

回答No.3

pen82

No.1です。

二つのタンパク質の発現量は、それぞれを単独で発現させた場合と同じくらいの割合でした。（単独で発現させた場合にも少ないものは、少なかったです。）発現量から見て、それぞれのプロモーターは独立して働いているのではないかと思われました。

mRNAについては、とってみたことがないためわかりません。

お礼

なるほど、蛋白質の相互作用をみたいときに使えそうですね。どうもありがとうございます。

回答No.2

takumicchi

直接的な答えではないですがアイデアを1つ（もう知っていたらすいません）。

二つのタンパクを共発現させるのにIRES(Internal Ribosome Entry Site)を
使ったbicistronicな系を構築してはどうでしょうか？
この場合プロモーターは1つで済みます。

構築方法としてはプロモーターの後ろを次のようにします。
（開始コドン---Protein1---終止コドン）-IRES-（開始コドン---Protein1---終止コドン）

Protein1はキャップ依存的に翻訳が開始され、Protein2はIRES依存的に翻訳が開始されます。1本のmRNAから2つのタンパクができるのでプロモーターの相性を考える必要はなくなると思います。

ただ、発現レベルとしてはIRESの強さにもよるので、どちらが強く発現するかは分かりません。確かク○ーンテック社からIRESの上流と下流にMCSがあるベクターが発売されています。

検討されてはいかがでしょうか。

お礼

ええ、１つのアイディアですね。ク○ーンテック社のマニュアルを見てみます。ちなみにウイルスに持ち込んで発現させたことはありますか？遅くなりましたが、ありがとうございます。

回答No.1

pen82

詳しく説明できるだけの知識はないので、経験論のみですが・・・。

私は、2種類の遺伝子を一つのプラスミドにつなぎ、大腸菌で二つのタンパク質を同時に発現させています。このとき、二つとも同じT7プロモーターを使用することが多いのですが、問題なく2つとも発現しているようです。

もっとも、これがSV40やCMVにも適用されるかどうかはわかりませんが。

お礼

タンパク質の発現レベルは2つとも同じくらいでしたか？また、その系で大腸菌からmRNA精製などは経験ありますでしょうか？早速のご返答ありがとうございます。