sv40 oriについて

質問

現在、目的タンパク質とEGFPをIRESを用いて共発現する安定発現株を
HeLa細胞において作製中なのですが、うまくいきません。

・蛍光を発している細胞が死滅してしまう
・蛍光が弱くなって確認できなくなってしまう

以上２点のうちどちらかが原因だと自分では思うのですが、
遺伝子導入に用いているプラスミドベクターにはsv40 oriが存在しており、これによりプラスミドが細胞内で複製されすぎて細胞が死ぬということは、このケースでは起こるでしょうか？

どなたか詳しい方よろしくお願いします。

回答No.1

MIYD · ベストアンサー

>・蛍光を発している細胞が死滅してしまう
EGFPのみを含むベクターとEGFPも含まないヌルベクターをコントロールとして入れれば、EGFPや目的の遺伝子が発現したときの影響を調べることが出来ます。

>・蛍光が弱くなって確認できなくなってしまう
サザンブロット解析や、半定量ゲノミックPCRなどで、外来性の遺伝子の量を調べることで、遺伝子をもったまま発現しなくなったかを調べることが出来ます。

>プラスミドが細胞内で複製されすぎて細胞が死ぬ
SV40oriを含む多くのベクターがHeLa細胞に入れられている報告があります。質問者さんのケースが過去の報告には無い特殊なベクターや条件でなければ、過去の報告からは否定されると思います。

お礼

ありがとうございます。
今回使用しているベクターも条件も特殊なものではないので
SV40 oriによって複製が進み、細胞が死んでいるとは考えにくいですね。

ブロット解析などを行い、発現を確認したいと思います。