CREB発現ベクター

質問

レポーター遺伝子を用いて転写活性を測定しているのですが、その際にclontech社のp-CMV CREBというプラスミドを同時に過剰発現させています。
しかし、あまり効果が見られず一体どうしたことかと思っております。
何か情報をお持ちの方、または実際に使用されている方の感想などお聞きできればと思っております。

回答No.2

Grace-Wonder · ベストアンサー

補足有り難うございます。

＞アッセイ系としましてはpGL3 vectorを用いたルシフェラーゼ活性の測定によるもので、細胞はrat-cortical neuronのprimaryです。

なるほどtranfectionの実験系としても、少し難しそうな系ですね。FuGENEとかお使いなんでしょうね。

＞CREレポーター(stratagene)も用いたのですが、やはりそれほどの活性上昇は認められず・・・

この系はTATAの最小プロモーターなのでシグナルが弱いことが多いようです。

＞フォルスコリンのような活性化剤はある遺伝子での活性上昇は認めていますのでcAMP系のシグナルは働いています。

なるほど。

＞少し思うのですが、転写因子の過剰発現というのはどの程度の活性変化が見られるのでしょう。転写因子余剰の場合、シグナルによる活性化（率）というのは相対的に減ってしまうんじゃないかなと最近危惧しています。

Case by caseです。
最近は活性化していない転写因子は、corepressorをrecruitしてしまうという話もありますので、その危惧は正しいともいえます。ドミナントアクティブ体を作製してoverexpreeionさせるしか、その答えは明らかにならないと思います。
　ちょっと思ったのですが、CREBのリン酸化がほんの一瞬だけ起こっているということはないでしょうか？昔、サイトカインでのCREの応答が非常に弱いので不思議に思っていた折、リン酸化部位抗体を用いてWestern blottingしてみました。すると刺激後10分位でCREBが活性化していたのですが、一時間後では元のレベルに戻っていました。レポーターアッセイというのは、一晩後とかのルシフェラーゼの蓄積で見る系ですから、この一瞬のactivationはdetect出来なかったわけです。もちろん、1時間後くらいでは、シグナルは弱くて見れませんでした。LPS刺激のときはレポーターでも十分シグナルは見られますが、これは24時間にわたって、ずっとCREBが活性化されていたせいでした。
　このようなこともありましたので、一度、調べて見てはいかがでしょうか？

補足

FuGENEは使っていません。実は手前どもで調整している試薬を使ったリン酸Ca法です。これでCo-transfection以外の転写活性化は十分見られるんです。ちょっとした我が研究室の誇りだそうです・・・

CREBのリン酸化についてなんですが、全くその通りでCREBのリン酸化は１時間程度で低下しました。しかし、あるCREB依存的に働くプロモーターの活性はその系を用いているにもかかわらず刺激後９時間に活性のピークが出現します。まさに「なんでだろ～」の世界です。

回答No.1

Grace-Wonder

全体の細胞系、アッセイ系やコンストラクトを特定していただけると良いのですが…。
CREBはリン酸化の状態などによっても、反応性が異なってきますので、CRE
reporter系などで見てるのであれば、細胞を変えてみたりするのも一手です。
cAMPなどでキチンと応答が見られる系なのでしょうか？？
補足お願いします。

補足

アッセイ系としましてはpGL3 vectorを用いたルシフェラーゼ活性の測定によるもので、細胞はrat-cortical neuronのprimaryです。
CREレポーター(stratagene)も用いたのですが、やはりそれほどの活性上昇は認められず・・・フォルスコリンのような活性化剤はある遺伝子での活性上昇は認めていますのでcAMP系のシグナルは働いています。
少し思うのですが、転写因子の過剰発現というのはどの程度の活性変化が見られるのでしょう。転写因子余剰の場合、シグナルによる活性化（率）というのは相対的に減ってしまうんじゃないかなと最近危惧しています。