タマネギの鱗葉表皮細胞を使ったGFP蛍光法について

質問

パーティクルガンを用いて、タマネギの鱗葉表皮細胞にGFPを導入する実験をおこなっています。
昨年の秋頃は成功していたのですが、最近は失敗続きです。
条件は変えておらず、問題点がどこにあるかわかりません。
以下の方法に問題点がありましたら、ご指摘お願いします。

【プラスミド】
カリフラワーモザイクウイルス35SとGFP遺伝子を結合

【タマネギ】
スーパーで購入したものを、1cmほど水をはった容器の中に、根が生えてくる方を下にして２日間放置。撃ちこみ直前に、タマネギを切って
1cm四方の鱗葉表皮を取り、MS培地上に置く。

【撃ちこみ】
650PSIでプラスミドを撃ちこんだ後、25℃・暗黒条件下で約20時間、MS培地に置く。その後、蛍光顕微鏡で確認。

これで光る細胞を確認しているのですが、１つも見つかりません。

成功していた時との違いはタマネギだけですので、様々なタマネギで試してみたのですが、全滅でした。
冬はタマネギが休眠（？）のようなものをしているのでGFPが発現しないのではないかと考えてもいるのですが・・・。
問題点、改善点などがありましたらご指導お願いいたします。

回答No.1

x0010

どんな条件で使っているかは分かりませんが、

プラスミドの損傷ではないでしょうか。

何回も解凍凍結を繰り返していませんか？

変異が入っていたり、プラスミド自体が分解されているとか・・・

一度プラスミドから目的遺伝子のシーケンスをしてみてはいかかでしょうか。