CREを用いたノックアウトマウスの作成

質問

バクテリオファージのCREタンパクはloxpという塩基配列を認識して２つのloxpではさまれた塩基配列を切り出す。
よってloxp間の遺伝子(エクソン)はCREによって欠損させることが可能である。

では、ある疾患に対し膵臓の内分泌細胞に問題があり、これには遺伝子Bがかかわっていることが予測されている。
そこでこの遺伝子Bが膵臓の内分泌細胞においてどのような役割があるか調べることにした。
遺伝子Bの機能を膵臓のない分泌細胞だけにおいて欠損させたマウスを以上のことから作りたい。

どうすればいいか？説明せよ。

という問題がありました。

解答が

１：B遺伝子をloxpで挟んだ遺伝子を作り、ホモ接合のマウスを得る。
ついで膵内分泌細胞で特異的に発現していると思われるプロモーター、エンハンサーの下流にCRE遺伝子をつないだDNAをマウス由来の受精卵に導入する。

２：　1と同じ手法で膵内分泌細胞でのみCREを発現しているマウスを作成し、１のマウスと交配する

というのが解答でした。
生物IIのノックアウトマウスの概念を呼んだことがあるだけで上記の答えをみると疑問が湧きました。

まず、１のステップではB遺伝子を切るためのアクションだというのはわかるのですがなぜCRE遺伝子をつないだものを受精卵に導入するのでしょうか。
受精卵に導入するだけでB遺伝子にloxpを挿入したように簡単にCREの機能を備えた遺伝子を受精卵に電気穿孔でいれるだけでCRE機能＋のマウスができてしまうのですか？

というかB遺伝子loxp(+)のホモを作成というステップ自体もそもそも受精卵にB遺伝子loxp(+)の遺伝子を受精卵に導入して作ったということなのでしょうか。

よく、ノックアウトマウスの説明をする際、超頻出文章で
「●●遺伝子のホモを作成」とありますがこのホモ接合体を作成＝受精卵への遺伝子導入
ということなのでしょうか。

そして問題なのは１のステップでは導入がうまくいけば

B遺伝子を切り取るマウスが出来上がる
はずですがなぜ

ステップ２を行う必要があるのでしょうか。どうして１だけでは膵臓のみでCREを発現しているマウスが得られたといえないのでしょうか。

そしてステップ２を行うならば最初から
「膵臓の内分泌でのみCREを発現する遺伝子操作をおこなったCRE結合遺伝子を受精卵に導入する」
ということで済むはずだと考えたのですがなぜそれでは駄目でわざわざ別々の方向からCREの制御をしているのでしょうか。
このままだと交配してホモを作成することも考えるとステップ１のCRE導入時にすでに膵内分泌特異的塩基配列の場所でCREをいれればいいのにと考えてしまいました。

長くなりましたが、時間はいつでもかまいませんので一つ一つ上記疑問点にお答えくださる方ご指導お願い申し上げます。

回答No.1

negigi · ベストアンサー

こういう模範解答って、基本的に文章を難しく書いて、解答者をけむにまいてると思います。

さて、

＞なぜCRE遺伝子をつないだものを受精卵に導入するのでしょうか。

そもそもですが、ステップ1で、2回に別けて遺伝子導入しているわけではなく、2種類の遺伝子改変マウスを作っている、ということは理解できていますか？ 「B遺伝子をloxPで挟んだマウスのホモ接合体 （B lox/lox）」と「膵内分泌細胞で特異的に発現していると思われるプロモーター、エンハンサーの下流にCRE遺伝子をつないだDNAを導入されたマウス （Panc-Cre +/）」です。

では、なぜ一度にやらずに2種類のマウスを作る必要があるのか。理由はいくつかありますが、単純に効率が悪いことや、手間が煩雑になることがあげられます（厳密には B lox/lox と Panc-Cre +/ は作成方法も違うのですが、ちょっと難しいのでここでは省略）。さらに、別々にマウスを作成しておけば、B遺伝子を他の組織でも特異的に欠損させたい、あるいはB遺伝子以外にも膵臓特異的に遺伝子欠損させたいときに、すぐにでもその実験に使える、という利点もあります。

ま、要するに、

＞１のステップではB遺伝子を切るためのアクション

これが、間違っています。B遺伝子を実際に切るのはステップ2です。B lox/lox　と　Panc-Cre +/ をかけ合わせて、B Panc-/+; Panc-Cre +/ を得、そのマウス同士を交配すれば、B Panc-/Panc-; Panc-Cre +/ (膵臓特異的B欠損マウス)が得られるという寸法です。

＞ホモ接合体を作成＝受精卵への遺伝子導入

一般的には、違います。B lox/+ と B lox/+ を交配させて、B lox/lox を作ることです。

お礼

ありがとうございます。
そして間違いの指摘とどうしてそういう操作をするのかをお教えいただき本当にたすかりました。また補足までお示しくださり本当にわからなかった部分の核に対してご指導を下さったおかげではじめと比べて理解に近づけました。今後ともよろしくお願い申し上げます。

回答No.2

negigi

あ、表記が楽なんで記号を使いましたが、よくよく読むとわかりにくいので、その部分も少し説明しておきます。

B lox/lox　　B遺伝子をloxPで挟んだホモマウス
B lox/+　　　　　　〃　　　　　　　　　　ヘテロマウス

Panc-Cre +/　　膵臓特異的Cre発現マウス（ホモかヘテロかは不明。理由は省略）

B Panc-/+　　　膵臓のみloxPで挟まれた領域が欠損した B lox/+ マウス
B Panc-/Panc-　　膵臓のみloxPで挟まれた領域が欠損した B lox/lox マウス

みたいな感じで読み取ってください。
Pancはpancreas（膵臓）のことです。

お礼

ご説明のおかげでようやく理解できそうです。ありがとうございます。