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アガロースゲル電気泳動におけるPCR産物バンドの乱れ
600 bpくらいのDNA配列をPCRで増やし、その産物をPEG沈して精製しているのですが、PCR直後の電気泳動（1.5% TBE gel)では1本のバンドなのですが、PEG沈後の電気泳動では2本になっています。 分子量で見ると、産物のバンド（600 bp）に加えて、450bp程度のバンドが新たに出現します。精製中に分解したのでしょうか？（でも、DNaseのコンタミだったらもっとズタズタに切れますよね）。それとも、精製過程で産物の一部が何か高次構造のようなものをとって、電気泳動上で二本になって見えるのでしょうか？ 原因についてご存知の方、あるいは同じ経験をされた方、教えてください。
- 生物学
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そうそう、ローディングバッファーが古くなって塩濃度が著しくおかしくなっていたりすると、バンドの移動度がおかしくなることあります。ローディングバッファーやマーカーのロットを違うの使ってたり、古くなってるの使ってたりはしませんか？ それとよく分からないんですが、バンドは２本に増えるんですか？それとも600だったのが450にシフトするって言うことですか？ どっちにしろ切り出して読んじゃうのがやっぱり早いかも。
お礼
バンドが2本に増えます。ただ、PEG前の泳動でも同じローディングバッファを使っており、こちらでは2本になったりしないのです。で、マーカーは全く問題なく泳動されているので、、、う～ん、なぜなんでしょうね。。。
こんにちは。 う～ん、全然わからないですね。不思議です。 一般的なアドバイスになってしまいますが、 ・PEG処理あり、なしでともに冷凍し、解凍して泳動 ・PEG以外の精製方法で精製する でやってみてそれでも同じ現象が起こるなら、もしかすると本当に配列特異的な何かなんでしょうか・・。 PEGでどうしても精製する必要がありますか？一般的な用途なら、とりあえずカラムかなんか試してみてはいかがでしょうか？
お礼
はい、ちょうど手元にカラムもあるので、これで一度精製してみようと思います。今まで慣例的にPEG沈でやっていたものですから。
うーん、そうですねぇ。 ・DNaseが入るとスメアになりますから、これは除外ですね。 ・DNAは物理的に安定ですからPEG沈ごときで切れることはないでしょう。 ・高次構造ですか・・・。プラスミドじゃないんで、ほとんどの例ではそんなにサイズはずれませんよ。私がやった中では最高で50bpです。ずれる時にはPCR直後からずれていました。 ・ゲルを見ないと分からないんですけど、nyanzowさんの言うとおり濃縮によって見えるようになったのが正解に近いかと。PCR後、フェノクロ・エタ沈濃縮したら、薄いバンドが1,2本でることはあります。 目的のバンドより明らかに薄いようでしたら気にせずちゃっちゃか切り出して次に進みましょう。
お礼
やはりDNaseではないですよね。そして、前のお礼でも書いたように、決まった長さの新バンドが出るというよりも、増幅産物の長さよりも150bp程低いところに出るのです（＝増幅産物の長さに合わせて、もうひとつのバンドの長さも変化する）。また、一度切り出した断片も、数日の冷凍保存の後に電気泳動したら、またバンドが増えているのです。。。ちなみに、増やしている産物は18S-rDNAと26S-rDNAの配列なのですが、配列特異的な原因でこのようなことが起こるのでしょうか？
こんにちは。 精製操作で600bpのフラグメントが切れることはまず無いでしょう。物理的に破損があったとしても、同じ場所できれいに、しかもバンドとして見えるほど大量に切れるとは全く考えられません。もしあったとしても残りの150bpの断片も見えても良いはずだし。 コンタミでなかったら、サンプルが濃縮されたために見えなかったバンドが見えるようになったとか？でしょうか。ちょっと分からないですけど、どうしても対処すべき問題なら、切り出して読んでみては？
お礼
今日さらにわかったことは、別のサイズの増幅断片（今度は550bp）でも同様のことが起こり、しかも150bp下がったところの400bpに新たなバンドが出ています。もしもTEやPEG等の中にDNAのコンタミがあったとしたら、どの大きさの産物を電気泳動しても同じ高さにコンタミバンドが見えるはずですよね。それがどうも、流す産物の断片長よりも150bp小さいところに出てくるようなのです。 しかもバンドの切り出しをやって精製したものを数日間冷凍保存し、これを電気泳動すると、また2本になっているのです。
私はTEにコンタミがありました（泣）
お礼
TEも大丈夫でした。
こんにちは。 PEGに450bpの断片がコンタミしてるってことはないですか？サンプルを入れないでDWに置き換えたコントロールをおいて試してみては？
お礼
コンタミについて調べてみたのですが、周辺試薬にコンタミはありませんでした。精製の途中で切れるなんてことは通常起こり得ないのでしょうか？
お礼
ご指摘の方法で実験をやっています。なるほど、ゲルの側面から見る方法ですね。これなら何か原因につながることがわかるかもしれません。やってみます。
補足
生じた短い500bpバンドの方を切り出してカラム精製して再度電気泳動したところ、なんと、分子量が600bpに戻っていました。つまり、分解とかではないようです。ただ、すぐ横に流しているマーカーでは分子量シフト等は起きていないので、ゲル調製の問題ではないようです。アプライ量が多いと、分子量シフトが起きたりするのでしょうか。。。原因はまだ不明ですが、解決しましたので、皆様有難うございました。