ImageJの使い方についてお教え下さい

質問

ImageJを使ってフィルム上のウェスタンブロットのバンドを定量解析する際のご質問です（2つございます）。添付画像の上の写真のようなバンドを解析しておりますが、バンドが太く、隣のバンドとくっついています。

自分のいつものやり方では、細長い四角形で一番左側を囲んで、Analyze→Gels→Select First Laneで確定した後、隣のレーンにずらしてSelect Next Laneで確定し、すべてを確定した後、Prot Laneで表示し、出てきた山の底辺と思われるところに線を引いて、魔法の杖で山の面積を数値化したものをバンドの定量値としております。その際、図のようにバンドが隣と重なり、更にレーンの幅が異なる場合、最初に確定した四角形を隣にずらしただけでは、別のレーンのバンドにも四角形がはみ出るため、正確に数値化できません。(1)途中で四角形の幅を変更することもできないようですが、このような場合にはどのように調整をしたら宜しいでしょうか？(2)また左から5番目のように非特異なバンドが解析対象バンドのすぐそばにある場合、添付画像の下の図の通り、どこが底辺かわからないような山が出てきます。左の大きい山が解析対象の山ですが、すぐ隣の山との境目のところから真下に線を引いてアバウトな境界を作ってそこまでを解析対象の面積を見なしても宜しいでしょうか？本来ならブロットのフィルムの方をベストの解析しやすいコンディションにするべきでしょうが、今回のケースにはいつも頭を悩まされています。具体的な解決方法がございましたら、ぜひともご教示をお願い申し上げます。

回答No.1

otx · ベストアンサー

この質問は既に、ImageJの使い方というよりも、

このデータの解析の方法で正しく評価できるか？
終には、このデータは正しいか？

という内容の是非になっていると思います。
そのことについては、無責任に「それでいいと思います」とは言えません。

唯一、コメントできるとすれば、
やはり、きちんと解析できるように
サンプルを適正な量だけアプライして
ウエスタンをし直すべきかと思います。

このような結果だと、強いシグナルのところは
値が吹っ切れていて正しい定量にはならない可能性もあります。
つまり、100が上限であるとすれば
100であっても10000であっても、おなじ100で検出されて
同じシグナルになってしまうということです。

正しい結果を解析するためには、急がば回れだと思います。
差し出がましくすみません。

お礼

お返事頂き有難うございました。
ウェスタンの解析はこれまでもきちんとしたことを習ったことがなく、我流でやっていたため、やっていた事に自信が持てませんでしたが、今回お返事を頂いたことで、やはりきちんと解析できるようにウェスタンの条件を適正化することが大事であるとよくわかりました。もう一度やり直してみようと思います。
またよろしくお願いします。