タンパク質の精製

質問

タンパク質の精製をカラムのどでする際に、グラジエントに塩を用いますよね？
塩濃度をあげることによって、タンパクの溶解度、又は目的タンパクと不純タンパクとの結合力の低下によって、分離できると聞きました。
その理由は何なのでしょうか？？
なぜ溶解度が上がったり、結合力が落ちたりするのでしょうか？？
どなたか教えてください。
よろしくお願いします。

回答No.3

otx · ベストアンサー

目的のタンパク質が正の電荷（プラス）だったら、カラムは負の電荷（マイナス）を使用します（逆も可能）。
この場合、NaCl溶液中の正の電荷を持ったNaイオン（プラス）が関係します。

イス取りゲームを想像してください。

イスがカラム。

座る人が、正の電荷を持ったタンパク質とNaイオン（NaClは溶液中では電離）。

最初は、塩を含まない溶液中で、イスにタンパク質を座らせます。
よくモノが「結合する」と言いますが、実はずーーと結合しているのではなく、結合している「時間が長い」もしくは「確立が高い」状態を
我々は「結合している」と言っているのです。
つまり、物質は常にくっついたり離れたりを繰り返しています。

さて、最初に戻って、イスにタンパク質を座らせます。この時、座っていると言っても、「座っている時間が長い」という状態です。
なので、見かけ上、ずっと座っているように見えます。

その状態でいるところに、もう１つ、イスに座ることができるNaイオンを入れてやります。

すると、数が限られたイスをタンパク質とNaイオンが取り合うことになります。
より「結合力が強い」タンパク質は「イスに座っている時間が長くなります」。
このとき、塩溶液は流れているわけですから、Naイオンとイスを取り合った結果、
イスに座ることが出来なくなった（イスに座る時間が短くなった）タンパク質は、しがみつくことが出来なくなるので、流れて行きます。

それで、塩溶液の濃度をどんどん高くすると、タンパク質をイスを取りあるNaイオンの数が多くなります。
すると、タンパク質は確率的にNaイオンよりイスに座りにくくなり、
元々イスに座ることが出来る力が強いタンパク質も座ってられなくなって、ついには、流れて行きます。

この、タンパク質とNaイオンのイス取りゲームをさせることで、イスに座る力が弱いタンパク質から順番に流れさせることで精製を行うのが
イオン交換クロマトグラフィーなのです。

タンパク質同士の結合の場合は、タンパク質中にあるイスをタンパク質が座るか、イオンが座るかという競争が起こります。
これもイオンが多いほど、タンパク質同士の結合を抑えます。

こういう風な「競争」を「競合させる」といって、生物学の実験ではよくやる手法です。
ドミナントネガティブとか、ある物質を大量に入れて機能を阻害するなど、上記の競争している想像は役に立つと思います。

＞タンパクの隙間に塩は簡単に入りこめるものなのでしょうか？？
タンパク質に比べてNaイオンとかは小さいと思うので、ある程度は入り込むのではないでしょうか・・・。
ここは曖昧です。詳しい人にお任せします。

お礼

『競合』の説明、とても分かりやすかったです。
ありがとうございました!!

回答No.2

otx

ちょっと難しいかもしれませんが、参考に。
http://www.gelifesciences.co.jp/newsletter/biodirect_mail/technical_tips/tips51.asp

タンパク質を構成するアミノ酸の側鎖の性質によって、タンパク質は電荷を持っています。
その電荷は、タンパク質が溶けている液のpH値によって、
プラスやマイナスになっています。
するとタンパク質全体的に正の電荷を持っていたり，負の電荷を持ってたりします（その電荷がちょうど０になるときを等電点といいます）。

イオン交換クロマトグラフィーは、それぞれのタンパク質の電荷の強さでわける精製法です。

すなわち、イオン交換担体は、正または負に荷電したイオン交換基を持つ粒子状の担体です。

例えば、精製したいタンパク質はpH６で正の電荷を持っているとします。その時は、負の電荷を持つ担体を使用します。
pH６の溶液にして、担体とタンパク質の溶液をインキュベートします。
すると、プラスとマイナスは引き合うので，結合します。このとき、pH６の溶液中で負の電荷を持つタンパク質は結合しないので除くことが出来ます。

インキュベートの後、負の電荷を持つ担体には様々な正に電荷したタンパク質が結合しています。

例えば、Aタンパク質は正の電荷が１つ存在するとします。
Bタンパク質には正の電荷が２つ存在するとします。
Cタンパク質には正の電荷が３つ存在するとします。

すると、負の電荷をもつ担体へのそれぞれのタンパク質の結合力は
C>B>Aとなります。

その担体に、NaCl溶液（pHまもちろん６）の溶液を薄い方から加えていきます。
すると、NaCl溶液にはナトリウムイオン（正の電荷）が含まれていますので、A,B,Cタンパク質が結合するはずの担体に結合することになります。

競合させて抽出するということ、わかるでしょうか？
タンパク質の結合力はC>B>Aでしたので、
薄いNaCl溶液ではAが外れてしまうけど、BとCはまだくっついていて、
NaClの濃度が高くなるにつれて、結合力が弱いタンパク質から、
担体に結合できなくなり落ちてくるということが起こります。

そうすると、A,B,Cタンパク質は違った濃度のNaCl溶液に溶け出すことになり、精製ができるということです。

＞又は目的タンパクと不純タンパクとの結合力の低下によって

これはタンパク質同士の結合様式のひとつであるイオン結合を、
NaClによってブロックしてタンパク質同士の結合を抑えるということです。

補足

丁寧な回答ありがとうございます！
イオン結合をNaClによってブロックするというのは、どういう現象でしょうか？？
イオン結合しているタンパク同士の隙間に塩が入りこんで、結合を弱めるという感じですか？？
もしそうであるなら、一般に、タンパクの隙間に塩は簡単に入りこめるものなのでしょうか？？

回答No.1

otx

それはイオン交換クロマトグラフィーでの話でしょうか？

補足

そうです。イオン交換です。
説明不足で申し訳ありません！