大腸菌からのHisタグタンパク質精製

質問

大腸菌からHisタグ付タンパク質(100kDa)を精製しているのですが、発現はたくさんしているのですが、His精製すると、フロースルーにたくさん落ちてしまい、一部しか精製できません。フロースルーを別のレジンでもう1度精製するとさらにまたフロースルーに落ちてしまい、またしても1部しか精製できません。精製できている1部は、レジンの説明書に書かれている精製可能なタンパク質量から考えると10分の1量ぐらいしかとれていません。また一度目の精製ではバックが高く、フロースルーをもちいた二度面の精製ではそのバックはかなり消えています。1度目の精製ではものよりもバックのほうがより結合しやすくなっているのでしょうか？CBBでみた発現量では圧倒的にもののほうがおおいのですが・・・分子量が大きいタンパク質ではこのような現象がおこるのでしょうか？何かご存知の方がいらっしゃいましたらお教えください。

回答No.6

toukitirou

No1であり、No5です。
しばらくネットができる環境にいなかったので、もう遅いかもしれませんが、詳しい組成を知る人物と明日あえるので、きいて、こちらに書き込みいたします。

回答No.5

toukitirou

No1です。
質問の答えではないのですが、His精製に関して思い出した事があるので書き足します。

友人が同様にフロースルーにでてしまい困っていたのですが、菌体破砕bufferの組成を変えたことで、劇的に結合するようになったという話です。

お礼

どうもありがとうございます。菌体破砕bufferの組成が問題ではないかとのご指摘を私も受けました。ソニケーションで破砕していたのですが、ソニケーションでの破砕はタンパクに悪い影響を与えることもあり注意が必要だといわれました。lysozymeのみで破砕したのですがそれではほとんど可溶性画分にほしいタンパクが来ませんでした。市販されている破砕bufferを試してみようと思っているのですが、劇的に結合するようになったという組成がどんなものだったか分かりますか？

回答No.4

pen82

No.2です。

ポリエチレンイミンで処理した直後のサンプルをキレートカラムにのせると、キレートしてある金属が還元されてレジンからはがれてくる可能性が高いです。ですから、処理後は透析などを行ってからカラムの方が良いと思います。

また、アマシャムの技術の方に聞いた話ですが、一般的にアフィニティカラムは、タンパク質濃度が薄いほど結合量が増えるそうです。できるだけ希釈してレジンに加えた方が（時間はかかりますが）良いそうです。No.1の方の補足にかかれてありますが、バッチでも大丈夫ですよ。チューブにタンパク質溶液と、レジンを1 mlくらい加えて、穏やかに攪拌しながら一晩置くというのをよくやります。

回答No.3

mizu_atsu

核酸の除去はやったことがあります。
ただしHisタグではなく普通のタンパク精製です。
ちなみに私の場合はプロタミンでやっていました。
ただ核酸がきちんと除去されているかは確認していますか？
UVで見ればきちんと除去できているかどうかの判別はつきます。
もしかすると処理が足らずに残っているかもしれませんよ。

回答No.2

pen82

菌破砕後、まずキレートカラムで精製でしょうか？

タンパク質の大きさの影響などは良くわかりませんが、目的のタンパク質に核酸がくっついてる場合、カラムへの結合が非常に弱いことがあります。核酸は、特異的な結合ではなく、ただ単にタンパク質の塩基性の部分に非特異的についているだけの場合もです。

この場合は、キレートカラムの前にイオン交換（DEAEやQセファロースなどを通すとうまくいくことがあります。

補足

核酸についてですが、破砕後にポリエチレンイミンで核酸を落とし、その後、硫安沈殿を行ってHisカラムで精製したことはありますが、特に改善はみられませんでした。硫安沈殿でロスったように感じたのが原因かもしれません。ポリエチレンイミンでの核酸除去は不十分でしょうか？　また、ポリエチレンイミン処理後、硫安沈殿などを行わずそのままHisカラムにもっていくのはやはり問題ありなのでしょうか？

回答No.1

toukitirou

100kDa以上のタンパク質は、可溶性条件では扱った事がないので(不溶化したものなら、可溶化剤添加のHis精製でうまくいきました)最後の質問に関してはわかりません。

ただ、バックの高さについては、発現した菌体破砕液を過剰に加えすぎると、そうなる傾向があるように思います。実際10培濃縮菌体lysateをアプライするところを、20培濃縮した菌体にかえると、バックはかなり高くなりました。
あと、60kDaの酵素を精製したときですが、発現量は変わらないのに、菌体の培養条件によって、Hisのつき方に違いが見られました。ですから、アプライする菌体の培養条件検討というのも必要な場合があるのかもしれません。

もう行っているかもしれませんが、His抗体でウエスタンして、染まらなかったらTagの付いたC末端、N末端のどちらかが分解を受けてしまっていたため、トラップされなかったということなのかもしれませんし・・・。

あとはbufferの塩濃度でしょうか。説明書の濃度は忘れましたが、私は150mMのNaClで行っています。

補足

お返事ありがとうございます。今は5倍希釈lyasateを用いて検討を行っています。10倍濃縮ではソニケーションでは破砕が困難だと判断しました（タンパク量が多すぎて）。Hisとlysateの液体量の比とかは問題ありますでしょうか？　QIAGENのプロトコールにはHisレジン 1mlにlysateを4mlと書かれていますが、Hisタンパク質の量さえあっていれば、lysateが倍の8mlあっても問題ないでしょうか？　空間的にレジンとのくっつきやすさとかが変わるってことありますでしょうか？（バッチでとると問題？）