DNAプローブの合成で

質問

ＤＮＡプローブを作ろうと考えています。ＤＮＡプローブを作るときは、1本鎖のＤＮＡをラベリングしなければならないらしいのですが、ＰＣＲ産物（あるいは精製したもの）を加熱して一本鎖にすれば良いのでしょうか？
また、参考にしている論文では、ＰＣＲ産物をベクターでクローニングしたものをラベリングしているのですが、何故でしょう？

回答No.3

robita · ベストアンサー

ren-ishizakiさん、こんにちは。

ren-ishizakiさんが、いろいろな掲示板に書き込んでいるようなのでここでレスをつけておきます。

>ＰＣＲ産物をベクターでクローニングしたものをラベリングしているのですが、何故でしょう？

ren-ishizakiさんの実験のクライテリアの問題だと思いますが、PCR産物がターゲットであることを確認しているのでしょうか？多分論文には
「PCR products are cloned into ___ vector by TA cloning and sequenced.」のようなことが書いてあったのではないですか？

＞＞PCR産物をベクターに（TA clonig用ベクターかな？）入れるのは単純に大腸菌にいれて増やすためじゃないでしょうか。

確かに大腸菌にいれて増やすためですが、そのほかに増幅産物がターゲットであることをシークエンスで確認するためでもあります。ユニバーサルプライマーを用いればインサートの配列確認ができますから。

＞＞インサートが１種類と分かっているのならいざしらず、TA cloningを行うということはインサートは様々なサイズのはずですよね（アガロースで流すとスメアになる）？それならばTA cloning vectorへライゲーションして大腸菌へのトランスフォーメーションが基本だと思います。

PCRのバンドが狙ったところに1本きれいに出てもCloningして配列確認は必ず行うのが基本だと思いますよ。片手間に行っても1週間もかからないんですから。（shimuraushiroさんあげあしとってごめんなさい。悪気はないのですよ。気になさらないで下さいね。）

あと、ren-ishizakiさんはin situ hybridyzationを行おうとしているようですが（組織切片を用いたほうですよね？）、PCR産物をラベルして用いてはいけません（これもren-ishizakiさんの実験のクライテリアによってしまいます。クライテリアの設定が高い人は一般的にその結果を信じないです。）。

in situ hybridyzationはRNA probeを用いるか、Oligo-DNA probeを用いるかのどちらかにしたほうが良いです。

PCR産物を用いたときアンチセンス側は良いとして、センス側はどう処理しますか？Anti-Sense mRNAが発現しているか、非特異的吸着かなにか分かりませんが、使用する組織によってはアンチセンスよりセンスのほうがシグナルが強く出てきてしまうことはしばしばあることです。

あと、簡便法をどこかで薦められていたと思いますが、簡便法はもともと多検体を処理するのに使用されていたものなので、ターゲットが2-3種類ほどなら基本に対して忠実に従ったほうが良いですよ。Cloningすれば両端にT7,T3,Sp6が付加されているのだからRNA probeを作成するのは容易でしょう。

もし、ren-ishizakiさんがin situ hybridyzationを一人で立ち上げなければならないならば、どこかに教わりに行くのはいかがですか？

補足

詳しい説明をありがとうございます。大変良く分かりました！
私は染色体へのin situ hybridyzationを行おうとしています。この場合はＤＮＡプローブで問題ないのでしょうか？

回答No.4

robita

ren-ishizakiさん、こんにちは。

組織切片へのin situ hybridyzationだと誤解しておりました。染色体に対するFISHに関してはうちは疾患遺伝子の同定とか行っているわけではないので残念ながら行ったことは無いです。

>この場合はＤＮＡプローブで問題ないのでしょうか？

素人考えでは問題なさそうな気がします。ただ、これに関しては実験したことが無いので何ともいえないです。

染色体に対するFISHに関しては秀潤社が細胞工学別冊プロトコルシリーズで「FISH実験法」「臨床FISH実験法」を出版しているようなので参考にしてみて下さい。あと、「non-RI 実験法」の中にも記述があったような気がします。

回答No.2

shimuraushiro

インサートが１種類と分かっているのならいざしらず、TA cloningを行うということはインサートは様々なサイズのはずですよね（アガロースで流すとスメアになる）？それならばTA cloning vectorへライゲーションして大腸菌へのトランスフォーメーションが基本だと思います。
ＰＣＲで増やしたdsDNAを熱してssDNAにしたものをラベリングしても大丈夫だとは思いますが、精製キットなどでPCR産物の純度を上げたほうがラベリングの効率が上がると思います。

どのような実験をしているかわからないので知ってることだけ書きましたが、分からないようでしたら補足してください。

回答No.1

shimuraushiro

１本鎖にしないとハイブリするDNAと付けません。ラベリングはアルホスなどでしょうか。PCR産物をベクターに（TA clonig用ベクターかな？）入れるのは単純に大腸菌にいれて増やすためじゃないでしょうか。

補足

ご回答ありがとうございます。TA clonig用ベクターです。ただ増やすだけだけでしたらＰＣＲで十分のような気がするのですが。ＰＣＲで増やしたdsDNAを熱してssDNAにしたものをラベリングしても大丈夫なのでしょうか？