アルカリSDS法について

質問

授業でアルカリSDS法を行なったときのことなのですが・・・
SolutionIを加えた後は、ボルテックスをかけるるのに、IIやIIIを加えた後はチューブを転倒させ混和させるように指示をされました。
なぜIを加えたの後はボルテックスかけてもいいのでしょうか？II、IIIの後はボルテックスしてはいけないのでしょうか？

初歩的な質問で申し訳ありません；

回答No.2

tatoo

Solution Iで大腸菌を懸濁しても、まだ大腸菌は壊れません。そのためプラスミドDNAはまだ大腸菌で守られている状態です。
そのため激しく懸濁しても問題ありません。むしろ、その後Solution IIで大腸菌をムラなく溶菌するためにきちんと懸濁することが重要です。
小麦粉を水に溶かすときによくなる「ダマ」のような状態に大腸菌をしないようにしっかり懸濁します。
次のSolution IIはアルカリ性であり、この時にプラスミドDNAに切れ目（ニックとよく言います）が入りやすい状態になります。
このときに物理的な力を加えると、切れ目が入ったプラスミドDNAを多くしてしまいます。
その次のSolution IIIでは溶液を中和し変成タンパク質とSDSが目に見えてわかるくらい固まりになっていたと思います。
この固まりにはプラスミドDNAと分離したいタンパク質とゲノムDNA
が固まってくれていて、遠心でのぞくことができます。
しかし、ボルテックスという物理的な力をかけると、せっかくできた固まりが小さくなってしまいます。

しかし、Solution IIとIIIをおのおの加えた後、ボルテックスはしては行けませんが、溶液がしっかり混ざるようにはしなくてないけません。

回答No.1

geneticist12

>SolutionIを加えた後は、ボルテックスをかけるるのに、

これはバッファーに大腸菌を再懸濁するためです。菌の塊が残ると、Solution II（Alkali/SDS）がしみこみにくく、溶菌がムラになってしまいます。

>IIやIIIを加えた後はチューブを転倒させ混和させる

Solution IIで溶菌して、ゲノムDNAを含む菌の中身が出てきます。そのせいでかなり高い粘性を持つので、vortexのような細かい振動ではかえって混和しにくいでしょう。
もっと大事なのは、このあとSolution IIIでタンパク質・変性したゲノムDNAとSDSの複合体を塩析して、沈殿として取り除くのですが、激しく撹拌すると、ゲノムDNAが断片化したり、塩析物が細かく粉砕されたりして、上清と分離しにくくなり、プラスミドの純度を下げる原因になるからです。