実験中の質問

質問

えーっと植物からのDNA抽出実験を行ったのですが
すりつぶした後にフェノール／クロロホルムを加え遠心分離しました。
すると3層に分かれたのです。
上層にはDNA、(RNAも？)、中間にできた膜にはタンパク質が、
そして下層(フェノール層)には
植物組織(細胞壁とか細胞膜)が溶けているのだとわかりました。
でもなぜこうなるのかわかりません。
簡単で結構ですので説明できる方教えてください。
またそれぞれの層にとけているもので他にもありましたらそれも教えてください

回答No.2

noname#53364 · ベストアンサー

少しだけヒントを、核酸、脂質の溶媒への溶解性、細胞壁の沈降係数、タンパク質の変性作用、を考えれば分かると思います。ほとんど答えですが。
おまけですが、その後アルコール沈殿しましたよね。なぜ落ちるか？ブタノール濃縮というものもありますよね。
フェノ・クロにするのも理由があります。単独ではどうなってしまうのか？ヒントは親和性です。

それぞれの相に溶けているものですが、それぞれの物質の溶解度を考えれば分かります。生体内にある物であと多いのは、糖や塩ですがどこにいったのでしょう。

お礼

ありがとうございます。
核酸・脂質の溶媒の溶解性・親水性・疎水性などの性質には気付きましたが
沈降係数まで頭が回りませんでした。アドバイス(答え)ありがとうございました。
フェノ／クロを使うのとフェノ単独で用いる違いは水層中のフェノール量の違い。あとフェノ／クロはイソロイシンやロイシンを変性させる。
こんな感じでしょうか？

回答No.5

noname#53364

フェノ・クロにする理由は半分あたってますね。もう一つフェノール相に溶け込む水の量を減らすという理由があります。二つあわせて分離をよくするといわれます。またこれは経験上の話ですが、クロロヒォルムをいれることでタンパクがパック（固まる）ようなんですよ。タンパク量が多い場合には少しクロロホルムをおおめにいれます。

水相に残ったフェノを除去するために、クロロフォルム抽出しませんでした？

お礼

あっ 水相にとけこむフェノール量が減るだけではなく
逆もあるんですね。これもDNAの収率UPへ役立ちそうですね。
フェノの処理にはクロロホルム・イソアミルアルコールを使いました。
イソアミルは界面活性剤として働くので、懸濁状態をより長時間維持するのに
用いたようです。
経験上のお話はとても参考になりますし、覚えておきたいと思います。
今回は本当にありがとうございました。
ポイントを入れておきます。

回答No.4

noname#53364

フェノ・クロにする理由は半分あたってますね。もう一つフェノール相に溶け込む水の量を減らすという理由があります。二つあわせて分離をよくするといわれます。またこれは経験上の話ですが、フェノをいれることでタンパクがパック（固まる）ようなんですよ。タンパク量が多い場合には少しクロロホルムをおおめにいれます。

水相に残ったフェノを除去するために、クロロフォルム抽出しませんでした？

回答No.3

knightgold

うる覚えですが、確か遠心分離てっのは、比重が大きかったり、分子量の大きさの順で分離するのであったようなきがしますが。
　ＤＮＡの遠心分離、よくやりましたよ。フェノールが手について真っ白になってああああてかんじの。
　あと溶けているものですが、下層には糖類が多いですね。塩類は分かりませんが昔のプロトコールには満遍なくあった気がしますが。（塩類は自信有りませんが、糖類はあります）

お礼

ありがとうございます。
もう一人の方の回答でもなんですが
比重とか分子量の大きさとかそういう物理的な面に
気付きませんでした。アドバイス＆お答えありがとうございます。

回答No.1

dragon-2

回答ではありません。ヒントとして以下のＵＲＬへ

参考URL：

http://page.freett.com/junw/MB/pureDNA/