RNAの単離について（フェノール抽出）

質問

DNAはフェノールにとけて、RNAはフェノールの溶けないのはなぜなんでしょうか？また、最終的に、RNAをエタノールで沈殿させ、抽出させるのですが、なぜ、RNAはエタノールで沈殿するのでしょうか？回答よろしくお願いします。

回答No.3

naomi2002

No.1+No.2さんのお答えで正しいと思いますが、「フェノールの酸性」について、ちょっとだけ追加します。

細胞から核酸を抽出精製する際に、邪魔になるものは主にタンパク質ですから、これをフェノールで変性沈澱させて除去します。
この際に水層のpHによって、水層に残る核酸がRNAのみであったり、DNAとRNAの両方であったりします。
水層が酸性のときは水層にRNAのみが残ります。塩基性のときは水層にDNAとRNAの両方が残ります。
この違いはNo.1さんのお答えにあるように、リボースの２位の水酸基の有無による親水性・疎水性の違いによるものと思われます。
DNAもRNAも酸性ですから、本来、塩基性バッファーに溶けやすく、酸性には溶けにくいはずです。しかしRNAには水酸基がDNAよりも１残基あたり１個多いので、親水性において優っており、そのために辛うじて酸性の水層にも残ることができるのだと思います。
ですからDNAが欲しい時は、TEバッファー（10mM Tris-HCl + 1mM EDTA, pH8.0)などで飽和させたフェノールを用います。一方、RNAを精製するときはDNAを除くほうが良いので、No.2さんがおっしゃるように、バッファーではなく水で飽和させたフェノールを使います。

フェノール自体はもちろん酸性ですが、TEなど塩基性バッファーで飽和させたものは、フェノール層も同じpH(8.0)になっているはずです。また水で飽和させたフェノールなら、もちろん酸性です。

回答No.2

buta_man

私もはっきりとはわかりませんが...

フェノールは酸性です。ただし、核酸抽出に用いる
フェノールは水飽和フェノールとか言われるもので、
本当に酸性がどうかわかりませんが、おそらく酸性
だとおもってよいと思います。

あと、分配される層の違いは、DNAとRNAの疎水性の
違いによります。RNAはリボースの水酸基があるため
水相に分配されます（DNAは疎水性の高いフェノール
層に分配されます）。酸性下でなくて起こるかどうか
はわたしもうろ覚えでよくわかりません。

なんかへぼい回答で申しわけありませんが、
とりあえず、今日わかるところで回答させて
いただきました。
明日、会社に行けば、本があるのでもっと正確な
答えができると思うのですが...すみません。

回答No.1

buta_man

多分、stepupさんがおっしゃっているのは
AGPC法のことだと思いますが、それと仮定して
話します。

最初の質問ですが、フェノール処理での話しですよね。
これは、RNAとDNAの構造の違いから来ています。
RNAのリボースはDNAのデオキシリボースに比して
2位の炭素に水酸基が一つ多くあります。

酸性下でフェノール処理するとDNAは疎水性にまさる
フェノール層に分配されますがRNAはリボースの
水酸基があるため水相に分配されます。

次の質問ですが、簡単に言ってしまうと塩析と
いう現象と思っていただいていいと思います。
アルコールと高濃度の塩によって、核酸に水和して
いる水分子が奪われることによって沈殿します。

ただし、これはDNAでも同じことが起こります。
ですから、DNAのコンタミがないよう、注意して
上清を回収してください。くれぐれもよくばらずに
ね。失敗したとおもったら、そのサンプルに再抽出
かけてね。それでは。

お礼

わかりやすい説明ありがとうございました。酸性下でフェノール処理すると・・、という部分についての、質問なんですが、これは、フェノールが酸性であるので、酸性下と言う事ができるのでしょうか？フェノール以外何も混ぜなかったのですが・・。

それと、ひとつ水酸基が少ないだけで、フェノール層に分配されてしまうのはなぜなんでしょうか？酸性下だからでしょうか？そこのところ、もしわかるなら、ぜひ教えていただきたいです。