プライマーダイマーが出てしまいます。

質問

PCRがうまくいきません。プライマーダイマーが出てしまいます。
鋳型DNAが少ないとできやすいと聞いた事があるのですが、鋳型はあまり
たくさんないので、増やす事もままなりません。
他に何か良い方法があったら教えて下さい。

Taqポリメラーゼを使っています。Hot Startしてもダメでした。

例えば、プライマーを減らしたりするのは有効でしょうか？？

回答No.1

noname#4684 · ベストアンサー

いちばん確実でシンプルな解決策は、プライマーを変更することだと思います。プライマーダイマーができてしまうということは、自分がデザインした２ヶのプライマーに、相補的な配列があるということです。アニールしてしまうのですから、温度や濃度などのファクターを変更しても、やはりアニールは起きてダイマーをつくりかねません。頑張っても徒労に終わる可能性があるので、相補的な部分をつくらないように、プライマー配列をデザインし直すのが早いと思います。

お礼

ありがとうございます。
実験の流れ的に、デザインを変えるのはできないんです…（Ｔ＿Ｔ）
でも他に解決方法がなければ、そうした方がいいかもしれないですね。。

回答No.3

noname#17364

こんにちは。
「ダイマーのせいで増幅されない」
「PCR条件が厳しいので増幅されない」
この二つをどうやって区別して、「ダイマーのせいだ」とおっしゃっているのですか？よろしければ教えてください。
私の印象では、条件を厳しくしたから（アニールしないために）かからないだけなのではないかと思ったのですが。

お礼

ありがとうございます。
以前に似たような実験をした時には、ダイマーもできず、泳動しても
なにもない、という状態でした。それをサザンハイブリダイゼーションで
みると、バンドが確認できました。それくらいの、少量のバンドを確認
したいと思っています。しかし今回はダイマーができているために、
本来の増幅領域は増幅されていない可能性が高い、と思いました。

アニールしないだけなら、ダイマーはできないと思ったのですが…。
確かに、条件を甘くするとかかってきます。

回答No.2

noname#17364

こんにちは。
　わたしもNo.1さんと同じ意見です。
　そもそもプライマーを設計する段階で、ダイマーを作らないように設計するのが普通です。
「流れ的に変えられない」と言う事情がよく分かりませんけれども、当たり前の前提を無視ししたところで実験が上手くすすむとは私は思いません。プライマーを作り直すのがまず先決です。

お礼

ありがとうございます。
一応ダイマーにならないように設計し、普通の条件では普通に増えるんですけれども、
きびしめの条件にするとダイマーが出てしまいます。
温度が高め、鋳型が少ない、という点が関係しているのでは、と思うのですが、
鋳型は増やせないんです。
流れ的に、と書きましたのは、今までは通常条件でこのプライマーで実験を進めており、
追加的な実験を行っているため、同じプライマーを使いたい、という意味です。
ヘンな書き方をしましてすいません。。
何かお知恵がありましたらよろしくお願いします。