免疫組織染色とDAPI について

質問

現在、核に局在すると推定しているタンパク質について免疫組織染色解析を行なっています。そこで、あわよくば細胞内局在まで見てやろうと思い、発色後の組織をDAPIで染色して観察しているのですが、どうも免疫染色のシグナルが強い切片ほどDAPIの蛍光が弱いのです。（DAPIは、ネガコンのpreabsorbedで最も良く染まり、次に抗体希釈条件によって免疫染色シグナルが弱いものが染まりやすいです。強く発色させたものでは、前二者で染まっていた細胞でも全くDAPI蛍光が観察できなかったりします。）
　そこで、質問なのですが、核にあるタンパク質に結合した一次・二次抗体および標識タンパク質や発色物質によってDAPIの浸透が阻害されるようなことはありえるのでしょうか？
　必要そうな諸条件を以下に書きます。
・ブロッキング：10%(w/v) BlockAce, 10%(v/v)ヤギ正常血清 in PBS
・一次抗体希釈液：0.3% PBS-BSAまたはCan get signal solutionA(TOYOBO)
・二次抗体：ビオチン化抗ウサギIgGヤギ抗体
・ABCキット：VECTASTAIN Elite
・発色試薬：DAB（Niは使用しない）
・DAPI染色：1 ug/mlで5 min（遮光）
・封入：余分なDAPI溶液を軽く除いてから、水溶性封入剤VectaMount AQ (VECTOR)、
・遮光して乾燥後観察

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

免疫染色のほうも蛍光ラベルのものを使ったらいいと思います。

おそらく、
1. DABの沈殿が励起光をクエンチしている（ベンゼン環をもっていて短波長を吸収しそう）
2. peroxidaseが作り出す過酸化物ラジカルがDNAをアタックして、染色性をわるくする

というような原因（きっと前者）だと思います。

お礼

ご回答ありがとうございます。

>免疫染色のほうも蛍光ラベルのものを使ったらいいと思います。
私も免疫染色でQ-dotを使うことを検討していました。早速試してみたいと思います。