免疫染色でシグナルが出ない。。

質問

2種類の別の抗原を認識する抗体で、卵巣を凍結して免疫染色を行いましたが、シグナルがみられません。。
－80℃の２－メチルブタノールで凍結後、切片を作製、アセトン固定後免染を行いました。
免染自体は、みな同じプロトコールなので問題ないと思います。
論文を参考に新しく抗体を買った(その論文では製造会社までしか指定がなく、型番までは不明)ので、失活していることはないはずです。
ただ、論文に書いてあった抗体候補は複数あり、違う抗体を買ってしまった可能性もあります。
最初、2次抗体を蛍光のものを用いたのですが、全体が薄く染まり、特異的なシグナルが見られませんでした。
そこで、ABC染色によりビオチンを介したのですが、本来でるはずのところには見られず、細胞がポツポツと卵胞の周りで染まっているだけでした。
抗体濃度は、データシートのスタート濃度でやっています。
この場合、次に何を試してみればいいでしょうか？？
抗体の賦活化はまだやったことがないので、次やってみようかと思っていますが、今回の結果で特異的に全くでていなかったので望み薄のようですが。。。
シグナルが出ない場合はみなさんはどのようなことを試すのでしょうか？
何か他に書いた方が答えやすいとのアドバイスもあれば、お願いします。

回答No.1

taronbe · ベストアンサー

卵巣と、一次抗体と、二次抗体の由来動物はなんでしょうか？ビオチン染色は二次抗体にビオチンを重合して行ったということでしょうか？
蛍光二次抗体あるいはビオチン重合二次抗体を用いた時、ネガティブとして一次抗体なしで染色した場合に差がありましたか？
自分でやってうまくいかないときはだいたいそのあたりからチェックしていきますが・・・

補足

お返事ありがとうございます。
卵巣はブタで、一次抗体はrabbit由来anti-humanと、mouse由来anti-humanです。
二次抗体はABCkitのビオチン重合されているものを使用しています。
ネガコンはまだ観ていなかったので、やってみます。

回答No.3

kuoyang100

kuoyang100です。ポリクロがSANT○ CR○Z社なら、まさしくそうです！！私の説明不足ですみません。
イニシャルでいうとS社です。カタカナで「ー」もカウントに入れると7文字の会社です→サン○　クルー○社です。
この会社の抗体はすごく当たりハズレが激しいです…
BD社は良いと思います。
C社はセ○　シグナリング社　U社はアッ○　ステイト社です。
分かりますね！

お礼

ク○ーズなんですね、ーはないのかと思ってました。
そぅなんですね、他の抗体試すしかないのでしょうか。。。

回答No.2

kuoyang100

抗体は、モノクロですか？ポリクロですか？
ポリクロでしたら、そのメーカーによっては、当たりハズレがあるものがあるようです。つまり、抗体のロット差が激しくて、その論文を書いた人達はその抗体でよく染まったのでしょうが、実際にその抗体を買って染めてみたら、全然染まらなかったって事がよくあるようです。
ここで具体的なメーカー名は書けませんが、イニシャルでいうとS社です。カタカナで「ー」もカウントに入れると7文字の会社です。ここの抗体は、そんな当たりハズレが激しいようです。
あと、M社も抗体の種類が多い割には品質の悪い抗体が多いと聞きます。評判がとても悪いです。
細心の注意を払っても何のシグナルも出ないようなら、カタログを広げて、他のメーカーの抗体を探してみてもいいかもしれないです。
参考までに、私たちの間で定評のあるメーカーですとアルファベットで書くとC社とU社がベストです。BD社も良いと思います。

お礼

抗体は片方はモノクロでもう片方はポリクロです。
ポリクロはSANT○ CR○Z社で、モノクロはBD社なので、
あげていただいた、よくない会社には入ってないんですね。。
うーん、どうしたらいいのか。。。