免疫染色の固定について

質問

お世話になっています。
免疫染色の際に、２次抗体後washまでは検鏡して細胞が形を保っているのに、その後乾燥させると細胞の形がなくなってしまうのは
固定がきちんとできていないのでしょうか？

4%パラホルムアルデヒド／PBSは1年ほど前に作成して－20度保存の物を用事溶解して使っているのですが…

心当たりのある方アドバイスお願いします。

回答No.2

qrl · ベストアンサー

その段階まで形が保てているのであれば固定は問題ないと思います。（私は作業が雑で細胞がカバーガラスから剥がれていってしまうことがよくありますが…）
それよりも、そのまま最後に試料を乾燥させるというのが何故なのか、よく分からないです。一般的には、最後は封入剤をスライドガラスに滴下して試料面を封入して四辺をマニキュアで固定して風乾して完成。だと思うのですが。

回答No.3

Dr_Hyper

染色後乾燥をさせるというのが、一般的な培養細胞の免疫染色ではないようです。乾燥させる必要性に対してもう少しご説明いただければご回答できるかと思いますが。
通常の固定であれば乾燥=脱水されれば細胞は形状を変えます。アルコール系で固定をした場合に乾燥させ、その後PBSに戻すなどは良くある手法ですが、今回の場合は染色後ですので特殊な手法か、
カバーグラスをかけてからの乾燥かどちらかかと思います。

お礼

お礼が遅くなりました。
みなさまありがとうございました。
みなさまのご指摘のように、風乾はいらなかったようです。
もらったマニュアルに改変を加えた人がいて
「表面を乾かす」
と書いてあったのが混乱を招いたようで、乾かす必要がなかったみたいです。
アドバイスのおかげで気づくことができ、良かったです。

回答No.1

geneticist12

>その後乾燥させると細胞の形がなくなってしまうのは固定がきちんとできていないのでしょうか？

どうやって乾燥させているかの問題かもしれません。たっぷり水を含んでいる状態からいきなり乾燥させれば、急激に膨圧を失いますし、水は表面張力が高く、水が減っていくときに強く細胞を引っ張る力が働くので、形態が保持されないことがあってもおかしくないです。アルコールシリーズで低濃度のアルコールから純アルコールあるいは有機溶媒まで順次置換するとか、表面張力の低いアセトンなどに置換するなどしてから、乾燥させてはどうですか（そもそも、その段階でどうしても乾燥させなければなりませんか？ウェットなまま封入はできませんか）。

お礼

回答ありがとうございます。
他のラボからもらったマニュアルも、一般的な本もむしろ
「風乾せよ」と書いてあるんですよね。
また、培養細胞で行っていますので、組織とも少々方法が異なり
アルコール系列などは使用しません。