免疫染色の方法について

質問

マウスの副腎の免疫蛍光染色をしようと思っています。
自分なりに考えた染色の方法を書くのでおかしいところや改善したほうが良いところを指摘していただけるとありがたいです。

副腎凍結切片（パラホルムアルデヒド固定）

PBS洗浄　×３　
１０ｍM　glycine-PBS(5min×３)
PBS洗浄
0.1%TritonX-100/PBS (RT,15min)
PBS洗浄 ×３
３％BSA-PBS　（RT、３０min）
１０ｍM　glycine-PBS(5min)
0.1％BSA-PBS(5min×３)
mouse-anti Ki67(1:50/1%BSA-PBS) (4℃、over night)
0.1％BSA-PBS(5min×３)
donkey-anti mouse Cy3(RT,60min)
0.1％BSA-PBS(5min×３)
F(ab')2 donkey-anti mouse(RT,60min)
0.1％BSA-PBS(5min×３)
rabbit-anti P450aldo(1;100/1%BSA-PBS)
mouse-anti P45011β（1;125/1%BSA-PBS）(4℃、over night)
0.1％BSA-PBS(5min×３)
goat-anti mouse Alexa488(1;100/1％BSA-PBS)
donkey-anti rabbit Cy5 (1;200/1％BSA-PBS)(RT,1hr)
0.1％BSA-PBS(5min×３)
封入

以上です。長い文章ですがお願いします。

回答No.3

otx

あと、マウスの組織をマウスの抗体で染めるというのは危険名のことなので、ニチレイのを参考にされてください。

http://www.nichirei.co.jp/bio/technical/protocol/meneki2/histatm/theory.html

回答No.2

otx

抗体を作用させるところ以外は特殊な方法でもなく、
一般的な方法でそう悪くはないと思います。

で抗体を作用させるところですが、
３重染色を行うところは、F(ab')2 donkey-anti mouseでブロッキングするということを私はしたことがありませんので、うまくいくかどうかわかりません。

色のかぶりと、抗体のかぶりにご注意を
まずは１つずつ染色した像を確認されることをお勧めします。

お礼

ありがとうございます。大変参考になりました。
とりあえず、１つずつ染色して像を確認していくところから始めていきたいと思います。

回答No.1

otx

抗体が沢山出てきてよくわかりません。

何をどの抗体でどう染めようというのでしょうか？

補足

mouse-anti Ki67（１次抗体）　
donkey-anti mouse Cy3（２次抗体）
F(ab')2 donkey-anti mouse（ブロッキング）
で増殖細胞を発色し、
rabbit-anti P450aldo（１次抗体）（P450aldo；副腎球状層に発現）
donkey-anti rabbit Cy5 （２次抗体）
で副腎の球状層を発色、
mouse-anti P45011β（１次抗体）（P45011β；副腎束状層に発現）
goat-anti mouse Alexa488（２次抗体）
で副腎の束状層を発色します。
この染色で副腎の球状層、束状層それぞれでの細胞増殖を観察したいと思っています。