シークエンス解析について

質問

シークエンスで元の配列と相同性を確認するのに皆さんどうやってやってますか？
ひとつひとつ見ながらやっていたら日が暮れませんか？
1500kbpとかあったら大変です。

回答No.7

Chicago243 · ベストアンサー

>エタチン、フェノール抽出後、70%エタノールでリン
>スしますが、これは洗浄が目的なんですよね？
塩がアルコールにそんなに多く解けないので、サンプルに塩が残っているのを防ぐのも洗う理由です。

>DNAは水よりTEに溶かした方がいいんじゃないでしょ
>うか。
仰る通りそのほうがベターです。そこそこ精製されたDNAは何度かタンパクを変性させるようなステップを踏んでますからDNaseのコンタミも気にしないでいいかなと思えますが、試薬、水、チーブといったものも疑うなら(たいていオートクレーブしてると思いますが)TEの方が無難です。水に少量のEDTA(0.1mM)を入れたものを使う人もいるようです。個人的には水で十分かなと思えるものは水に溶かしています。

お礼

ありがとうございます。助かりました。
また、分からないことがあったら
質問するかもしれません。

回答No.6

Chicago243

>吸光度比（260/280）が1.8はあるので綺麗なプラスミ
>ドですよね？

表面上はいいですね。でもエタチン後あるいはカラム精製でのアルコールの持ち込みとか吸光度比だけでは分からない部分もあります。DNAを使った実験でうまく行かない時は１度クロロフォルム抽出をして、エタチンご70%エタノールで洗い、エタノールを除いてから水に溶解するという操作は結構やられていると思います。

>ABIって対応いいんですかね？
ま、そんなによくないかもしれませんが、売る側も基礎データーを取っているわけですし、何処が弱点でということもある程度分かっているはずですから、それにその商品を買って使っているわけですからとことん追及しますね、私の場合。

補足

エタチン、フェノール抽出後、70%エタノールでリンスしますが、これは洗浄が目的なんですよね？
DNAは水よりTEに溶かした方がいいんじゃないでしょうか。キレート作用があるEDTAが入っている方がいいと思うのですが。

ABIに問い合わせみることにします。
この業界では大手みたいですからね。

回答No.5

Chicago243

>綺麗な波形がとれるまで何回もやるべきでしょうか？
やみくもにやるのもどうかと思いますが、きれいに取れる可能性があるならやっても良いと思います。
BigDyeを使ったシーケンスでは(多分ほかの蛍光色素を使ったものも)完全に分け切れなかった未反応物がじゃまをすることがあります。正確にはちょっといえませんが(手元にデーターがないので)最初の何ベースかあたりと、100bpぐらいのあたりとあと400bpぐらいのとこかな(すいません場所には自身がありません)に出てきます。こういう場合はかけ直しても良いでしょう。また、やったことはないのですが、再精製して未反応物を完全に取り除くものてかもしれません。
あとBigDyeならABIに聞いてみてもいいかもしれません。先に勝手にテキストの塩基を書き換えていいいかという質問がありましたが、ABIはマトリクスの間違え易い傾向とか知っていると思います。どうしてもGに見えるのにAとアウトプットされるような感じであればそちらのほうがいいかもしれません。

>ピーク強度が弱いのですが、
>何が原因だと思いますか？

いろいろあると思います。DNA量が少ないと起こりがちです。私はDNA量はプロトコールが推奨している濃度より3-5倍多くしてます。あとBigDyeなら、従来の1/4-1/8に希釈した反応溶液でも反応が進むので薄い溶液で反応させることが多いようです。でも読みづらいとか問題がある場合は1/6で使っているのを1/4-1/3にとか少し濃いめにするのも手だと思います。あとDNAがあまりきれいでないかもしれません。フェノールとクロロフォルムで精製してみるのも場合によっては有効です。

あとプライマーが原因になることがあります。プライマーがアニーリングするべき配列と似た配列がどこかにあったりとかです。PCRでもそうですがうまくいくようにデザインしたはずでもうまく行かないことがあるようです。

補足

吸光度比（260/280）が1.8はあるので綺麗なプラスミドですよね？ABIって対応いいんですかね？

回答No.4

Chicago243

＞＞波形が重なっている時は一方がバックグランドレベ
＞＞ルでピークが出ている時があります。周りの波形を
＞＞見てその判断をすればいいと思います。

＞どういうことですか？
＞勝手に判断して塩基が間違っていることが
＞あってはいけないと思うのですが。

たまに、反応の効率が悪いせいか、あるいは大量に一気にシーケンスするためテンプレートの量を一つずつ合わせ切れないため、テンプレートの量が少なくなってしまったサンプルとかではシーケンスの波形のしたに地をはうように同じ間隔でバックグランドが出ます。たまたまシーケンスの本当のピークが低くなってそのバックグランドに紛れてしまうことがあります。こういう時はシーケンスを間違えて読んでる可能せいがあるので注意すべきだということです。

回答No.3

Chicago243

>波形がおかしくなったり、重なったりするとNが出る
>といいんですが、違う塩基と解釈するときがあります
>よね？
そうですねそういう意味で波形が乱れているところはチェックしておかないとテキストの配列をうのみにすると間違った配列をそのまま結果と思ってしまう可能性があります。

波形が重なっている時は一方がバックグランドレベルでピークが出ている時があります。周りの波形を見てその判断をすればいいと思います。

極端に波形が乱れた場合はやりなおすか、違うプライマーのデーター(反対からよんだもの、一部オーバーラップしたところ)などを参照し解決できる場合はそれで良いでしょう。配列の特徴で弱くなりがちな物はやはり反対からよんだほうが結論が出しやすいことが多々あります。ほぼ同じ配列を読んでいてどのサンプルも同じところでトラブルがあるなら反対から読んだり違う方法を取るべきでしょうし、たまたま一つだけならやり直すだけできれいに読める可能性が高いです。

たまにシャープなピークと、バックグランドのドリフト(なだらかな変動)のピークが重なり、なだらかな方をピークとして認識してしまったりします。そういう時はシャープなピークがホントのピークなので、やり直さずに書き換えてしまっても問題がないと思います。

お礼

綺麗な波形がとれるまで何回もやるべきでしょうか？
ピーク強度が弱いのですが、
何が原因だと思いますか？

補足

＞波形が重なっている時は一方がバックグランドレベルでピークが出ている時があります。周りの波形を見てその判断をすればいいと思います。

どういうことですか？
勝手に判断して塩基が間違っていることが
あってはいけないと思うのですが。

回答No.2

Chicago243

>相同性も調べるCGIですか？
説明不足でした。ホモロジーを調べるものです。多分作成したプラスミドかなにかにミューテーションが入ってないかどうかとか、ある病気の人や生物のDNAに変異がないかとか調べているのだとおもいますが、正しいと思われる配列と、シーケンスした配列をいれて走らすと一致している場所のアライメントをアウトプットしてくれます。従来そういう目的のものではないかもしれませんが、十分機能してくれると思います。

>geneticsにはそのような機能はないのですか？
あったと思います。
http://www.sdc.co.jp/genetyx/new/20051121/g8news.html

>シークエンスって波形もある程度見ないといけなくないですか？
機械は信用できないといってしまえば昔の人間のようですが、少し波形が乱れるとアルゴリズムでうまく処理できず違う塩基を表示することがあります。あと人のゲノムからの配列であればヘテロなのでシーケンスがだぶりますから、そこの表記が必ずNになっているとは限りません。

補足

波形がおかしくなったり、重なったりするとNが出ると
いいんですが、違う塩基と解釈するときがありますよね？
そういうときはそのデータ信用できませんよね？
シークエンスをやり直した方がいいんでしょうか？

回答No.1

Chicago243

波形を丹念に調べる必要があるなら別ですが、アウトプットされたテキストの比較なら
BLAST 2とか、複数あればマルチプルアライメントソフトclustal Wなど使えばいいかと思いますが。
この手のプログラムはDNA解析用ソフトに組み込まれてますよ。

参考URL：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi

お礼

参考URLは何なのですか？
相同性も調べるCGIですか？

補足

geneticsにはそのような機能はないのですか？
シークエンスって波形もある程度見ないといけなくないですか？