変異が入ってしまって困っています。

質問

ターゲット遺伝子がベクターに入った状態で、変異プライマー、ベクターの制限酵素を修飾するようなプライマー、ベクター配列由来のユニバーサルプライマーの4種のプライマーを使って、PCRで部位特異的に変異を導入しようとしたのですが、入るべき変異箇所以外に変異が入ったクローンが高頻度で含まれてしまいます。ポリメーラゼは忠実度が高いものを使用しているのですが、何故このような現象が頻繁に起こってしまうのでしょうか？また改善点などございましたら、ご教授願えないでしょうか。よろしくお願いいたします。

回答No.4

Dr_Hyper

余計な部位に入る変異は、いつも同じですか？
全くのランダムですか？

補足

変異は箇所も塩基置換の種類も全くのランダムです。また変異が導入された領域は、プライマーの配列とは無関係でした。

回答No.3

Dr_Hyper

変異の入った配列のPCR primer　Mとその相補配列をもつM' として、insertの5'側の配列をもつprimer5'
insert３’末端の相補鎖、、、この場合はユニバーサルprimerをお使いですか？
で1st PCRとは、
5'-M'でPCRをかける
M-3' primerでPCRをかける

この反応液をまぜて5' 3'のprimerを再度いれてPCRをかけることで変異の入ったinsertを得ます。
primerを４本とおっしゃったので、てっきりこの手法だと思いましたが、違いましたか？

補足

ご回答ありがとうございます。insertの5'と3'の外側のプライマーはユニバーサルプライマーです。手法ですが、4本のprimerを使うことは使うのですが少し違います。宝酒造さんキットにも採用されている方法でMR(Modified Restriction)法と呼ばれているものです。

回答No.2

Dr_Hyper

1.　余計な変異の入っている箇所は、primerと無関係ですか？
2.　1st PCR 2nd PCRどちらとも２０サイクル以下にしていますか？
3.　dNTP MgCl2などの濃度は逸脱していませんか？

primerの張り付きの問題であれば、一本ずつprimerを抜いていったコントロールをとれば目的の長さのinsertが増えているかどうか判断がつきます。

補足

ご助言ありがとうございます。余計な変異箇所はprimerと無関係だと思います。また1st PCR、2nd PCRとはどの段階のPCRだと解釈すればよいでしょうか？dNTP,MgCl2濃度は添付の説明書どおりです。

回答No.1

alice_with_tak

ターゲット遺伝子中に目的部位以外に用いているプライマーが張り付きやすいような配列はないでしょうか？またアニーリング温度が低すぎしないでしょうか？
上記以外の原因が考えられるようでしたら、PCR以外の方法で変異導入を考えてみてはいかがでしょうか。
http://www.promega.co.jp/Cre_Html.php3?pGMPID=0707001#
当方ではこちらのキットを用いて変異導入を行っています。

補足

アニーリング温度は60度に設定しております。またPCR以外の方法への以降も視野にいれ検討してみます。