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カビの同定方法について
私は卒論研究でカビ由来の酵素精製・クローニングを行っているのですが、あるときコンタミかあるいは突然変異を起こしたらしく、全く知らないコロニーをつくるようになってしまいました。この未知菌の同定法として、18srRNAの解析をやれといわれたのですが、このプロトコールがなくやり方が分かりません。この18srRNAの配列をPCRで増幅してシークエンサーにかければいいと思うのですけれども、この配列を増やすためプライマーが必要になってくると思うのですけれども、未知菌においてどうやって設計すればいいのでしょうか教えてください
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縮重プライマーというのは基本的にアミノ酸配列からプライマーを設計する場合に用いる方法です。なのであくまで応用的にできるのではないかということです。すみません。 アミノ酸はコドンが1つのものもあれば6つのものもありますよね。1つだったらそのままの配列を用いればいいのですが、複数の場合はどのコドンでもいいようにプライマーを設計しなければなりません。バイオ実験イラストレイテッドという本の３巻に詳しく書いてあります。例えばFVACYというアミノ酸配列部分でプライマーを設計するとすればFは2、Vは4、Aは4、Cは2、Yは2種類のコドンをもっているので128通りのプライマーを設計すればどれかがぴったりと当てはまるというわけです。私は大体1000通りくらいにおさまるように設計しています。すべての組み合わせのプライマーを注文するわけではなく例えばグリシンGであればGGNというふうに注文すると4種類のプライマーがほぼ均等な量で含まれているものが送られてきます。TorCであればY、など記号が決まっているので注意してください。またあまりにも組み合わせが増えてしまった場合にはイノシンを代わりに入れてあげるといいみたいです（イノシンはどの塩基とも結合しない代わりにアニーリングにも干渉しません）。ただイノシンを含む場合にはPCRで使う酵素にエキソヌクレアーゼ活性をもつものを使うことができなくなるようです。 DDBJなどのデータベースから20種類くらいの種の18srRNAの塩基配列を拾ってきて配列解析ソフトを使って並べ、同じような配列の部分を探して縮重プライマーを設計すればPCRで増幅が可能なのではないかと思います。
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- alice_with_tak
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縮重プライマーを設計することはできないでしょうか？種が違えば配列は異なるのですが、全く異なっているわけではなく似ている（保存されている）配列部分があるとおもいます。その部分で縮重プライマーを設計すればPCRによる増幅が可能であると思います。
お礼
解答ありがとうございます。DNA操作の初心者なんで、縮重プライマーというものが良く分からないので教えていただけるとうれしいのですが。参考文献でもあればお願いします。付け加えて、今回のコンタミ菌は原核か真核かも分からない（多分糸状菌か放線菌かと）のですがこの方法はてきようできるのでしょうか？
お礼
解答ありがとうございました。この方法で実験を行ってみたいと思います。ありがとうございました。