GFPのプライマーについて

質問

GFPとルシフェラーゼ遺伝子を目的遺伝子と融合させるときのプライマーの設計方法を教えてください。GFPとルシフェラーゼは目的遺伝子の前と後ろにつけたいのですが、それぞれの開始コドンと終止コドンはどう処理したらよいでしょうか。さらに制限酵素サイトも入れたいのですが、配列をあまり変えずに導入する場合の気をつける点など教えてください。

回答No.2

Penfield · ベストアンサー

ＧＦＰ－目的遺伝子－ルシフェラーゼ
と言う順番ですね。
ならば、まず、GFPのＣ末にマルチクローニングサイト(MCS)があるベクターを買います。論文などを見ると、クロンテック社のpEGFP-C1ベクターがよく使われていると思います。

　そのMCSの一番下流の制限酵素サイト（もし、pEGFP-C1ならBamH1だったかな？）にルシフェラーゼ遺伝子をコドンがちゃんと合うようにクローニングします。もちろんルシフェラーゼにBamH1サイトがある場合は他の制限酵素サイトを使う必要がありますが、BamH1の切り口が同じBgl2を使うこともできます。両方が使えない場合は、他のサイトを使ってください。また、このときルシフェラーゼの開始コドンを含めないほうがいいと思います。終止コドンは個人の好みです。僕だったら、そのまま使います。
ルシフェラーゼの開始コドンを含めないのは、ルシフェラーゼがGFPとの融合蛋白質としてではなく単独で発現する可能性を除くためです。

　上記で作ったベクターに目的遺伝子をクローニングすれば出来上がりです。目的遺伝子は少なくとも終止コドンを削る必要があります。僕は削りますが、なぜか開始コドンについては結構そのままつけている人が多いようです。

＞さらに制限酵素サイトも入れたいのですが、配列をあまり変えずに導入する場合の気をつける点など教えてください。
と言うところがよく理解できないのですが、ＯＲＦの直前もしくは直後に制限酵素サイトを入れればいいのではないかと。
caaacgatgcatcaATGgctagctgtcaという配列なら
もし、開始コドンを削る場合は
caaacgatgcaGAATTCgctagctgtcaという風に
もし、開始コドンを削らない場合は
caaacgatGAATTCATGgctagctgtcaという風にします。
ただ、上記の例は制限酵素サイトとコドンが具体的には書けないので適当に書きました。

　最後に、ＧＦＰからルシフェラーゼまで翻訳されることを確認した上で、プライマーを注文しましょう。

お礼

ありがとうございました。あまりプライマーを作ったことがないので、コドンをどうしたらいいのか、とても困っていました。単独で発現しないようにしたらいいんですね。無事設計することができたので、早速注文します。

回答No.3

Penfield

No1は書きかけのものを間違って投稿してしまいました。すいません。
No2が正式な回答です。

回答No.1

Penfield

ＧＦＰ－目的遺伝子－ルシフェラーゼ
と言う順番ですね。
ならば、まず、GFPのＣ末にマルチクローニングサイト(MCS)があるベクターを買います。論文などを見ると、クロンテック社のpEGFP-C1ベクターがよく使われていると思います。

　そのMCSの一番下流の制限酵素サイト（もし、pEGFP-C1ならBamH1だったかな？）にルシフェラーゼ遺伝子をコドンがちゃんと合うようにクローニングします。もちろんルシフェラーゼにBamH1サイトがある場合は他の制限酵素サイトを使う必要がありますが、BamH1の切り口が同じBgl2を使うこともできます。両方が使えない場合は、他のサイトを使ってください。また、このときルシフェラーゼの開始コドンを含めないほうがいいと思います。終止コドンは個人の好みです。僕だったら、そのまま使います。
ルシフェラーゼの開始コドンを含めないのは、ルシフェラーゼがGFPとの融合蛋白質としてではなく単独で発現する可能性を除くためです。

　上記で作ったベクターに目的遺伝子をクローニングすれば出来上がりです。目的遺伝子は少なくとも終止コドンを削る必要があります。僕は削りますが、なぜか開始コドンについては結構そのままつけている人が多いようです。

＞さらに制限酵素サイトも入れたいのですが、配列をあまり変えずに導入する場合の気をつける点など教えてください。
と言うところがよく理解できないのですが、それぞれの直前に制限酵素サイトを入れればいいのではないかと。
終止コドンたとえば、caaacgatgcatcaATGgctagctgtcaという配列ならcaaacgatgcaGAATTCgctagctgtcaという風にします。