制限酵素処理

質問

制限酵素処理をしました。
急な用事が入り37℃でインキュベートのまま2日間そのままにしていました。
その結果、マーカーとコントロールとして未処理のものを一緒に泳動したが両方ともはっきりバンドが見えるが、処理したものは欲しいと思っていたバンドが多少見えるがその下にグラーデーションで、はっきりしたバンドではなく白いものが見える。
150マイクロリットルをウェルが小さかったので50ずつに分けて泳動した。三つ全て同様にはっきりしたバンドが見えなかった。
制限酵素は特異的な配列で切れるはずだからこんな風な結果になるのはどこに原因があるのか分かりません。
教えてください。

回答No.3

blackdragon · ベストアンサー

認識部位が緩むといっても、完全に非特異的に切れるわけではないので、３７℃程度では、熱による加水分解とは考えにくいです。

従って、微量に混入していたDNaseによる分解を受けたためというのが、最も考えられる可能性です。

これを避けるためには、もちろん、処理時間を長く取り過ぎないことが大切ですが、この他に、制限酵素を入れる前の段階で、70度10分程度の熱処理で、DNaseを失活させておくことも有効な場合があります。

回答No.2

TCA

制限酵素の中には高グリセロール濃度で特異性が失われるものがあります。
インキュベートの間、チューブのフタの温度が液温より低いと、反応液の水分だけ蒸発してしまうことがあります。このとき制限酵素の原液に含まれていたグリセロールが濃縮されて、反応液中のグリセロール濃度が高くなり、予期せぬ切断が起こる事があります。

回答No.1

MIYD

実際にDNAを分解したのがコンタミしたnucleaseなのか、制限酵素の非特異な反応なのか、熱による加水分解なのかはわかりませんが、
どこに原因があるのかといえば2日間そのままにしていたところでしょう。

特異的な配列で切れるはずとかかれていますが、
カタログのスター活性に付いての記述を読んでから実験をすることをお勧めします。
酵素と条件によっては一晩インキュベートするだけでDNAがずたずたになります。