イヌのプライマーを探してます

質問

初めて質問させていただきます。
イヌ(ビーグル犬)の血管平滑筋の評価としてmyosin heavy chain(MHC)のRT-PCRがしたいのですが、プライマーがうまく見つかりません。

種がイヌということであまり参考文献が見つからない中、2－3の論文にプライマーの配列が記載されていたのですが作製して使用するもまったくバンドが出ませんでした。条件は94-15s,55-15s,72-15sの30cyclesです。GAPDHなどはしっかり発現しているためcDNAには問題ないと思います。

同じようなことを研究されている方がもしいらしたら、再現性の高い記載のある論文、配列が調べられるサイト、または血管平滑筋の評価としてMHCではなく他の蛋白を使ってますなどの情報がいただけたら幸いです。
年末年始のお忙しいところに申し訳ありませんが、どうぞよろしくお願い致します。

回答No.2

TCA

イヌ血管平滑筋について、この文献はいかがでしょうか。
http://highwire.stanford.edu/cgi/medline/pmid;8763409

イヌの遺伝子を扱ったことはありませんが、PCRのアニーリング温度は（プライマーのTm）－5　℃程度を、伸長反応の時間は1kb伸ばすのに1分を目安にしていました。

お礼

参考にさせていただきました。返事がおそくなり申し訳ありません。
アニーリングの条件も振って至適条件を探しております。本当にありがとうございました。

回答No.1

MIYD

イヌ由来のDNAでPCRをかけたことはありませんが、

PCRの条件は機械によってそれなりにずれが生じることがあります。
特にアニールの温度がずれると増幅に大きく影響を与えます。
また、伸長反応も もう少し伸ばすと増えが良くなるかもしれません。

もう少し条件をふってみてはいかがでしょうか。

お礼

返事が大変遅くなりました。
プライマーを変更した後、annealingの条件を振ってみたところ発現するようになりました。ご親切にありがとうございました。