ELISAの洗いについて

質問

96-well plateのELISAでハイブリドーマ細胞のスクリーニングを行なっていますが、wellの間でコンタミネーションがあるようです。

というのも、
１．ネガティブコントロールがかなり高い値を出すことがある。
２．プレートの端の方が高い値が出やすい。
からです。

プレートを洗うときは150マイクロリットルの洗浄液を12連ピペットで加え、プレートをさかさまにして洗浄液を落とし、ペーパータオルに叩いて余分な洗浄液を取るのですが、プレートをさかさまにしたときにコンタミしているのではと思っています。
どうしたらコンタミを防げるかご存知のかた、教えてください。

細口のボトルを使う方法、蛇口の水道水を使う方法、バケツに入れた洗浄液で洗う方法などあるようですが、そのようなやり方でうまくいった方も教えてください。
よろしくお願いします。

回答No.2

liq · ベストアンサー

洗浄方法ですが、洗浄液は、ほぼいっぱいになるまでいれてください。平底プレートなら150では少なすぎるのでは？洗浄回数は、条件の検討により増減はありますが、ウェルの液を捨てた後洗浄液を3回入れ捨てするが標準的だと思います。

コンタミネーションを疑っているのなら、検体を捨てた後の洗いを注意深くやってみてください。例えば、液を捨てる時に下からのはね返りがないよう注意する、液を切る時にはプレートをペーパータオルに叩きつけるのではなくプレートにペーパータオルをあててそれを手でもって反対側の手に叩きつける、ピペットチップはプレートに触れさせない、等です。

プレートの端の方が高い値、というのは、入れる順番による時間差、室温以外で反応させているのなら温度差、発色時遮光しているのならそのやり方が不完全、プレートの品質が良くない、などの要因も考えられると思います。

お礼

150は少なすぎるのですね。
いっそ洗浄瓶を使うことも検討してみます。
跳ね返りはいつも心配の種でした。
反対の手に叩きつけるのは検体を一度捨ててからでしょうか？
端の方が高い値になるのにはいろいろ原因が考えられるのですね。
参考になります。
どうもありがとうございました。

回答No.4

mousevshuman

モノクロスクリーニングの際のELISAなら水道水で充分です　私は、シャワー式の蛇口から出た水道水で洗っています　やり方は、プレートを一気に振って抗体液などを排出し、すぐにシャワー水でプレートに水をかけます　そうすれば、すぐにウエルには水が満たされます　この操作を５回くらい繰り返せば完全にウエルの洗浄が出来ます　最後にプレートを良く振って水を切り、念のためペーパータオルの上で、ウエルを下にしてたたけば水分を除去できます　この方法ならご質問のようなウエル間のコンタミもありませんし、洗浄も充分に出来ます　また、シグナルが低くなることもありませんし、簡単ですよ

お礼

モノクロスクリーニング、とは定量ではないELISAという意味でしょうか？
水道水でも大丈夫だとずいぶん楽になります。
一度試しにやってみたいと思います。
どうもありがとうございました。

回答No.3

liq

私は液を捨てる時にはバケツかバットにゴミ袋をしいて捨てていますが、最初にペーパータオルをしいておいて、あとは使用済みのペーパータオルをこの中に捨てています。吸水性のものがあればはね返りはかなり防げると思うからです。

プレートを逆さにして液を捨て、クッと軽く水気を切ってから、ペーパータオルの上に置き（逆さのままプレート表に紙をあてる）片手でそのままプレートを持ち（プレートに紙をあてて固定）、もう片方の手のひらにたたきつけます。そこまで気にする必要はないのかもしれませんが、ウェルに残った検体が他のウェルのふちにつくのをなるべく防ぐ気持ちで、初回はこうしています。洗浄液をいれたらもうあまり気にしなくてもよいと思います。

お礼

なるほど。合理的ですね。
この洗い方を次回ぜひ試してみたいと思います。
どうもありがとうございました。

回答No.1

shimuraushiro

私のやり方を書きます。96WELLプレートには300マイクロリットル洗浄液を入れて３回洗ってます。最後の基質を入れた後の洗いは４～５回行っています。私はプレートはキムタオルを何枚か重ねた所でパンパン叩いていますが、プレートが壊れる位おもいっきり叩いても大丈夫だと思います。正に最後は力技です。

良い抗体が取れると良いですね。

お礼

300マイクロというとウェルいっぱいですね。
基質を入れたあとに洗うんですか？
その部分はプロトコルが違うのかもしれません。
どうもありがとうございました。