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ELISA法でバックのOD値が高くて困っています。

2011/08/02 12:31

ELISAキット(サンドイッチ法)を使ってヒト血清と血漿中のタンパク定量を行っているのですが、ブランクの吸光度が高く困っています。ブランクにはキット付属の濃度0のスタンダード溶液、スタンダード用バッファー、サンプル用バッファー、こちらで用意したMilliQ水を用いており、OD値がいずれのブランクも同じくらいの値を示し、約0.2～0.6、平均0.4ほど出ています。このキットでの実験は10回ほど行っており、ブランクのOD値を差し引いて作成した検量線のR^2値は0.98以上で正常だと思います。また、他のELISAキットも数種類扱っていますが、それらではブランク値が0.1を超えたり、スタンダードカーブの値がプロトコルに記載されているものから極端に外れた結果は出た事がありません。洗浄方法は、1ウェルあたり100 uL入っている溶液を棄ててから250 uLの付属洗浄バッファーを加え、手で軽く揺らした後に棄てる操作を5回繰り返しています。シンクには吸水用のタオルを敷いており、水切りは洗浄液が完全になくなるまでプレートを新しいキムタオルの上に叩きつけています。ウェルの乾燥を防ぐためにこのステップは計10分以内に終わらせています。ピペットはマルチチャンネルのものを使っているのでサンプル以外の溶液の添加にはあまり時間がかかっておらず、また添加時にチップを液面やプレート壁面には触れさせていません。プロトコルでは指示されていませんがBSAでブロッキングをしたり、洗浄回数を増やしてみたりしましたが改善されませんでした。発色時間を下げると全体のシグナルが弱くなり、検量線の下の方の領域においてあまり良い値が得られませんでした。その他は基本的にプロトコル通りに操作しています。情報不足かもしれませんが、何か改善点についてお気づきになられましたらご教授願います。