RNAi 実験における細胞トラブル

質問

24welに接着細胞をps-(ペニシリン・ストレプトマイシン－)のMediumで播種し
24hr後にOligofectaminesi,siRNA,Opti-MEM,でComplexを100nM,50nM,20nM(siRNA濃度」で作成し
Complexを添加する前に、Opti-MEMで１度洗浄してから（血清あり→血清なしへ)添加して
24hr,48hrで細胞生存率をみているのですが・・

添加する前に顕微鏡で見る限りは細胞がいるのに
添加した後に顕微鏡で見ると細胞が少なくなるのです

手技やアスピレーターで吸うときの勢い・添加時の水流で細胞が流されているのかと考え
現在は１wellごとチップで吸っていっているのですが、それでも少しの改善程度です

また、今月の頭から24well plateで生存率の実験をし始めたころから
細胞の調子がなんだかおかしく・・
コンタミのように、接着している細胞もいるのですが浮いたりして白く濁ったり
あきらかコンタミみたいに黒い塊みたいなものが浮いていたりするのです
なんだか気持が悪く、細胞をここ最近捨てては新しいのを起こしたりしている状態です。

これは、ペニストなしのMediumで少し長い時間かけて継代してしまうのが原因なのでしょうか？
また、OligofectamineやsiRNAによる毒性が原因なのでしょうか？

6well palteで定量的遺伝子発現量の抑制確認実験をしていたときは
細胞が劇的にいなくなったり、細胞の調子がおかしくなるということもなかったのですが

6well plateからplateを96wellや24wellに変えてスケールダウンしたころからおかしいのです。

もし、何かお気づきの点や考えられる点がありましたら
助言いただけるとうれしいです、お願いいたします。

回答No.1

otx

>添加する前に顕微鏡で見る限りは細胞がいるのに
添加した後に顕微鏡で見ると細胞が少なくなるのです

これは添加直後（数秒以内）のことでしょうか？

もしそうなら、

添加前→顕微鏡で確認
添加後→数秒後に確認
その後培地を抜いて新しい培地に入れ替え→顕微鏡で確認

してみてください。

リポフェクションの溶液によって、光の屈折率が変わり、
光学顕微鏡ではあたかも「見えなくなる」という現象が
小さいwelだとたまにあります。