ELISAについて・・・

質問

ELISA法の　サンドイッチ法で実験をしています。
　最初の抗体を固相化させる段階で抗体の濃度は
全く一緒だけど、量を変えて固相化させたプレート
をつくってみました。　具体的には200μｌ/wellを 100μｌ/well
に変更して撒いてみました。
すると他の試薬の濃度やLotは全く変わってないのに
countが著しく上昇してしまいました。
未熟者なのでいったいどういった原因が考えられる
のかわかりません。　希釈の間違い以外で
原因は考えられるものでしょうか？

回答No.2

Grace-Wonder

ご参考になるか、分かりませんが　お答えします。
１）私が扱ったタンパクの中で最も吸着性が高いものはTween存在下でも well壁に50-70％が吸着するサイトカインでした（＠4℃、素材がPSでもPPでもほぼ同様。等電点沈殿による物でもありません。）。このような場合、希釈系列を作製する場合にも問題になるほどです。そこで、溶液のｐH、塩濃度などの条件検討を行い、pH6、1M NaCl、0.1%BSAの条件で吸着を抑えられることが判明しました。このようなタンパクは非常にrareかもしれませんが、可能性は考慮すべきと思います。
３）私も因果関係は良く分かりませんが、実験的に何か関連性が見出されるかもしれない、と思ったのです。

以上、何かのヒントになれば幸いです。

回答No.1

Grace-Wonder

状況が良くつかめていないのかもしれませんが、
１）
１次抗体でコートされていない部分（ウェルの側面の上の部分；２００と１００での液面の違いでできる側面部分）に、抗原、すなわち測定したいタンパク質などが非特異的に吸着してしまっているのではないでしょうか？
２）その後の操作も、すべて半分の液量で測って見られてはいかがでしょうか？
３）また、200uLを100uLにした際の、表面積の違いは問題になりませんか？
など　考えてみるべきことはあります。

補足

大変参考になるご意見ありがとうございます。
Grace-Wonderさんのご意見を伺って　もう少し
伺ってみたいことが、できてしまいました。
　1) １次抗体でコートしたあとポストコーティング
　　　液を250μｌ/wellで撒きます。ポストコーティン
　　　グ液中には非特異的吸着を防止するために
　　　Tween 20が含まれているのですが
　　　それでもやはり1次抗体でコートされていない
　　　部分というのは抗原の非特異的吸着を
　　　受けやすいものなのでしょうか？

2) 　3）でご回答頂いたように100μｌの方が
　　　200μｌより比表面積が大きくなると思いますが
　　　それとcountの上昇の因果関係が良くわかりませ　　　ん　　全く想像がつかないのでよろしければお教　　　えください

　素人なもので妙な質問で申し訳ありません
　お時間のあるとき、によろしければお教えください