ELISAについて

質問

ELISAでハイブリドーマのスクリーニングをしようと思います。プレートに吸着させるタンパクは、回収したあと再使用（次のプレートに吸着）できるんでしょうか。できるなら何回ぐらい再使用できますか。もしそういうことをしたら、スクリーニングの精度はかなり落ちるのでしょうか。タンパクが高いので節約したいのです。よろしくお願いいたします。

回答No.2

ademu2 · ベストアンサー

私の読み間違いでした。ブロッキング剤か何かと勘違いしておりました。
しかし、説明をみた限りではやはり何枚も使用するのが危険のように感じます。確かに濃度を下げてコーティングすることは可能でしょうが、感度がそれに伴って悪くなるように感じます。それでも良いというのでしたら問題ないでしょうが、論文にするのでしたら既製の方法の方が安心できます。また、改良するのでしたらそれなりに前試験もおこなわないとその実験における信頼性が低くなると思います。
それでも良いというのでしたら、全体の濃度を低くしてプレート全部が同じ条件になるようにするべきだと思います。使用した液の残りを使用するのだけは止めたほうがいいです。
あと、参考にまでしていただきたいのですが、プレートにコーティングするのではなくビーズにコーティングするという方法もあります。こちらの方法ですと使用する数だけビーズを使えばよいのですからブランクになるプレートが無駄にならなくてすみます（いわゆるビーズ固相法）。これだったら一定の濃度の溶液を作ってビーズを漬けて長時間反応させればより多くのものができるように思います。ビーズは小さければそれほど多く作れますし、表面積も大きいですから反応には向いていると思います。

お礼

ご回答ありがとうございます。
濃度を振ってみてどの程度までが許せる範囲か調べてみようと思います。
ビーズ法、勉強します。なかなか便利そうですね。

補足

とりあえず薄い濃度で吸着をためしてみました。
5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml、0.15625μg/mlまでではpositiveのものはnegativeの５倍程度の吸光度がでました。実際のスクリーニングには0.3125μg/mlくらいで使ってみようか、と思っていますが、いかがでしょうか。

回答No.3

ademu2

ｐｏｓｉｔｉｖｅとｎｅｇａｔｉｖｅを各々10回ずつ測定して有為差があれば問題ないと思います。
あと、Ｆａｌｓｅ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅがでないかも調べた方がよいと思います。

お礼

ありがとうございました。
まず有意差でそうです。false positiveもでませんでした。
またなにか問題があったときには、ご助言お願いいたします。

回答No.1

ademu2

確かにそういうこともできなくはありません。プレート１枚１枚を全く別のものとして考えるならそれでも可能でしょうが、当然ながら蛋白がプレートに吸着するのですからどんどん溶液中の蛋白濃度も低下していきます。そうすれば同じ時間反応させておいてもだんだんプレートへ吸着する蛋白の濃度も低下していきます。そうすれば当然ながらプレート個々の反応性も変化してきます。つまりロット間差が大きくなるわけです。各プレート毎にスタンダードをたてて測定するものでしたら多少の誤差でも補正できるでしょうが、定性反応などでしてらまず無理でしょう。
蛋白が高いとありましたが、本当にそうなのでしょうか？以外と計算するとそんなに高いとは思いませんが。
ちなみに蛋白とは何でどれくらいの濃度を使用するのでしょうか？ＢＳＡやＨＳＡでも1ｇ１０００円くらいのものでしょ？

お礼

ありがとうございます。
タンパクはグロースファクターで、数十μgで数万円なんです。すでにコートされた市販のものもあるのですが、それは１枚で数万円・・・。ハイブリドーマスクリーニングだけで、こまかい定量は不要なんで、できれば安くたくさんの検査がしたいのです。濃度は５μg/mlくらいにうすめてコートしようと思っていました。しかしそうすれば50μgで10mlしかできず１枚しか作れないことになってしまいます。プレートごとにスタンダードをたてて測定すれば、５枚、１０枚くらい使えるんでしょうか。それとも最初からもっと薄い濃度でコートしたほうがいいのでしょうか。
質問ばかりで申し訳ありませんが、よろしくお願いいたします。