3T3-L1を用いた脂肪細胞分化に関する活性試験について

質問

現在、3T3-L1を用いてadipogenesis assayを行っていますが、毎回結果にバラツキがあり、このサンプルに分化に関わる効果がないのか、それとも実験の方法や手際の悪さから値がばらついているのか判断が難しく、とても困っています。
毎回ＳＤ値を算出し、その値から外れるものは除外、という形を取っていますが、再現性がうまく得られません。
以下に実験の概要を記載しますので、もしよろしければアドバイスや注意、またご意見など頂ければと思います。
どうぞよろしくお願い致します。

・96wellプレートを用い、一番外側のwellは使用しないようにしています。ちなみに、n=3～4程度で行っています。
・細胞は1.0×10の5乗 cells/mlで播種しています。
・adipogenesis assayに関してはCayman Chemical Companyさんのアッセイキットを用いて実験を行っています。大まかなプロトコルは以下のとおりです。
(1)day 0 :プレートへの細胞の播種
(2)day 2 :細胞にinductionをかける（insulin、Dexamethazone、IBMX）+サンプル投与
(3)day 5 :培地交換(→insulinのみを含む培地）＋サンプル投与
(4)day 7 :培地交換(→insulinのみを含む培地）+サンプル投与
(5)day 9 :oil red Oを用いた染色と抽出
染色後、抽出液を用いて抽出し、プレートリーダーで吸光度測定しています。
・これまでに以下の改善を試みました。
(1)新しい細胞の起こし直し、サンプルの作り直し
(2)high glucose mediumを使用する
(3)培地交換時のcellの吸引への配慮

長文になってしまい大変申し訳ありません。よろしくお願い致します。

回答No.1

TOMmkII

１年ほど3T3-L1を使ったことがあるのでその経験からですが、
この細胞は分化にむらが出やすいので、手技が悪いというよりは
目的の結果を得るには手法そのものに限界があると考えた方がよいでしょう

改善できる点としては以下のあたりでしょうか
・96wellプレート
扱いやすい細胞によるアッセイであれば96wellでよいのですが
3T3-L1では24wellできれば6wellあたりを使用した方がよいでしょう
・分化条件
(2)のday2は他のプロトコールに比べ早めと思います
もう少し延ばした方が安定するかもしれません
・Oil-Red-O染色
より感度の高い測定法、例えばGPDH活性測定キットを使用する方法もあります
ただ煩雑なことと蛍光リーダーも必要になるので、必要ならばという程度です
・細胞ラインを変える
継代により分化能が低下しますのでこれも手の一つです
ラボにより状態が違い良いラインほどアッセイも安定します

なおこちらの掲示板で質問した方が適切な回答が得られるかもしれません
3T3-L1に関しても過去ログを検索すればいくつか出てきますよ
http://jtca.umin.jp/

お礼

そうなのですか！ここ半年ほど同じ実験から前に進めず、どうしたものかと思っていましたが、そもそも分化にむらが出やすい細胞なのですね。
確かに、いくつか論文を読んだ限りでは96wellプレート使用している例が少なかったように思います。ほとんどがdishなどだったような。。。
また、day2が早いとの事、プレーティングをしてからの期間を一日延ばして実験してみようかと思います。
GPDHもやってようと思ったのですが、私の研究室で行っている人がおらず確立がとても大変そうで臆病になってしまって…
今後もうまくいかないようでしたら検討してみたいと思います。
いただいたURLでも3T3-L1に対する多くの質問があり、とても参考になりました！
頂いたアドバイスを実験に取り入れ、再度がんばってみたいと思います！
本当にありがとうございました。