プライマーの除去について

質問

現在リアルタイムPCRのスタンダードを作るためにPCR産物に含まれるプライマーを除去しようとしているのですが、どうもうまくいきません。

手法としてマイクロスピンカラムS-400HR（GEヘルスケア）とPEG沈を試してみましたが、どうしても500ng/ul近くあったDNA濃度が10ng/ulあたりにまで落ちてしまいます。

スピンカラムでは回転数を800～3000×g、遠心時間を1～4分など条件をいろいろ変えて試してみました。

PEG沈では上清を捨てる際沈澱も流してしまったのではないかと思い（沈澱は見えていませんでした）、エタ沈メイトで沈殿の位置を可視化して注意深く操作してみましたが結果は同じでした。

ちなみに扱っているDNAはβ-actinの部分的配列など、どれも150～200bp程度です。
DNAの長さに問題があるのかとも考え、500bpぐらいのを使ってスピンカラムとPEG沈をやってみましたがだめでした。

やはり自分に技術的な問題があるのでしょうか・・・。
どなたかご教授お願いします。

回答No.3

RNase_P · ベストアンサー

補足ありがとうございました。

一点気になったのですがPCR後の産物を，そのまま吸光測定したものと
精製後に吸光測定したものを比較していないでしょうか?

PCR後の産物はprimerや反応しなかったdNTPs由来の吸光もありますので
産物だけを精製したものは見かけ上吸光度が大きく落ちます。

他の回答者様も仰るとおり
アガロースでもPAGEでも構わないので一度泳動して
濃度の見積もりと精製をすることをお勧めします。

お礼

RNase_Pさんが仰る比較をまさにしていました！
たしかにプライマーやdNTPは過剰に入っていますし、正確な測定はできないのですね・・・。
やはりカラムとPEG沈はうまくいかないので、ゲルの切り出しをやってみたいと思います！
どうもありがとうございました！

回答No.2

CTAB

PEG沈等のプロトコルについては詳細もきかずに無責任なことをいうのは何なので、なんとなくアドバイス的なものを。

わたしの場合、リアルタイムのスタンダードはサブマリン電気泳動と切り出しで作っていました。目的断片のみなら一番確実かと。PEG沈やカラムだと鋳型が残りますしね。

あと、カラムも使ったことありますが、回収10%以下は方法の問題ではないと思います。取り説どおりやれば、ほぼ全て回収できるはずですよね。PEG沈はプロトコルが問題かもしれませんがカラムも総量が減るというのは実験の方法以外に問題がある気がします。

NanoDropは使った事ないのですが、スペクトルではなく電気泳動の光量で調べて見るのもいいも知れません。機械の問題とか試薬の阻害により、正確に測れていない可能性もありますから。

というわけで、切り出しによる精製と、PEGやカラムの精製後に電気泳動を行ってみるのがいいかと思います。

お礼

カラムは何人か周りの人がやっても駄目だったのでカラム自体に問題があるのかもしれません・・・。
またPEGで捨てた上清を電気泳動にかけてみたところバンドが検出され沈殿していないことがわかりました。（誤って流してしまった可能性もありますが、理由についてはまだよく分かっていません・・・）
総合して考えるとゲルの切り出しが一番良い方法に思えました。
どうもありがとうございました！

回答No.1

RNase_P

後は限外濾過などの方法もあります。
どの手法をとるにしろ
総量の減少は避けられません。
質問には濃度しか書いてありませんが
総量はどのくらい減少しているのでしょうか？
また濃度測定はどのように行っていますか？

補足

失礼しました。
濃度測定はNanoDropを使って測定しています。
溶液が25ulあったので総量は10ugぐらい減っていると思います。