大腸菌内での遺伝子発現について

質問

２つ教えていただきたいことがあります。

質問１．プラスミド（pUCやpBR322など）のMCSに複数の遺伝子を別々の制限酵素サイトで入れた場合、大腸菌の中で別々のタンパクとして発現されるのでしょうか？　たとえば、ベータガラクトシダーゼの遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子をMCSに入れても、両方とも機能するのでしょうか？

質問２．プラスミド（pUCやpBR322など）にハイグロマイシン耐性遺伝子を付け加えたいのですが、PCRでハイグロマイシン耐性遺伝子のORFを増やしてpUCやpBR322などのMCSあるいは、プラスミドバックボーンのどこか（丁度使いやすい制限酵素サイトがある場所など）に組み込むことで大腸菌内で機能しますでしょうか？

よろしくお願いいたします。

回答No.1

bioxyz · ベストアンサー

質問１　例に挙げられているプラスミドは遺伝子発現用プラスミドですので、ORFをひとつだけ入れるのが一般的です。ふたつ入れた場合、後ろの遺伝子はほとんど発現しないか僅かだけ発現します。ただ、必要であればリボソームのエントリー配列を入れて複数の遺伝子を発現できるように工夫することも可能かと思います。実際に製品化されているものもあるとうろ覚えしてますので、カタログ等で配列を確認してみてください。
もうひとつの方法で、こちらの方が一般的ですが、一方の遺伝子は全く関係ない領域に挿入します。この場合、例えばカナマイシン耐性遺伝子であれば、マップでその領域として記されている配列を、ORF前後のプロモーター等の配列を含んだまま挿入します。挿入部位は、Amp耐性遺伝子（Ampを使用したい場合のみ）、GALプロモーターからMCSあたりまで（使用したい場合のみ）とレプリコンを壊さなければ普通は大丈夫です。

質問２　MCSにひとつだけ入れるならそれで大丈夫ですが、他の本来の目的遺伝子があるのならばバックボーンにするべきです。その場合、質問１の回答に書いたように、ORFだけだと働かない可能性があります。プロモーターごと持ってくるべきです。PCRを用いる場合は、PCRエラーにも注意してください。

お礼

なかなか専門書を見てもわからないことでしたので、助かりました。
ありがとうございました。