酵素インベルターゼの精製について

質問

酵母から粗抽出、熱処理、エタノール沈殿の三段階の操作を行って酵素インベルターゼを部分精製し、その活性を調べるという実験をしました。
結果は、インベルターゼ活性は段階を踏むごとに低下しました。
感覚的にはなんとなくわかるのですが、原理が全くわかりません。

かなり大雑把な説明のため不明な点があると思いますが、分かる範囲で答えます。
よろしくお願いします。

回答No.3

yanachu · ベストアンサー

補足ありがとうございました。

授業での実験ということは、再実験はできないですね？
できるのであれば、いろいろ条件を変えて試験を行うことを提案しようとしていたのですが、
ふと「授業の実験なら無理かな？」と思ったので補足要求した次第です。

さて、「なぜ活性は段階を踏むごとに低下したか？」を考察しなければいけないとして回答します。

答えは「考えられるあらゆる可能性を解答せよ」ですね。
ごめんなさい。トピ主さんの期待した回答ではないですよね。

>エタ沈によって酵素が一部変性してしまったために活性が低下してしまったと考えてよいでしょうか？

レポートに上記のように書くだけでは満点取れません。
私が先生なら20点くらいしかつけないでしょう。
（あなたの先生がどうかは分かりませんが…）

酵素の精製についての実験ですから、当然酵素の勉強をしなければいけませんね。

酵素の性質ってなんでしたか？
・基質特異性がある
・至適温度、ｐHがある→過酷な温度・ｐH、重金属などによって変性する。
・活性部位の種類、切断様式
・酵素の種類（プロテアーゼ、フォスファターゼ、キナーゼ、アミラーゼ、、、、山ほどあります）
・酵素力価とは…
・酵素反応速度論

ぱぱっと考えたくらいでこれくらいは出ますね。もっとありそう。

他に精製についての勉強なら
・タンパク質精製の種類（静電的性質を利用したもの、分子の大きさを利用したもの、基質特異性を利用したもの…山ほどあります）
・インベルターゼの性質から適当と思われる精製法は？

これらを踏まえて、行った実験手順、結果から考察をします。

「なぜ活性は段階を踏むごとに低下したか？」

本当にエタノールによる変性だけが理由でしょうか？
だったら熱処理（インベルターゼ以外の酵素を失活させる目的？）では活性は低下しないはずですよね。
こたえは一つじゃないと思いますよ。

そもそも、活性は本当に低下していたんでしょうか？
トータルの酵素量が減れば、反応時間が一緒なら、分解量も減りませんか？

ぜひ、いろんな観点から考察してみてください。

レポートは、結果や答えではなく、考察が大事です。
その考察に至った過程というものが、今後役に立つんですよ。

お礼

回答ありがとうございます！

あぁ～なるほど！！！
って思いました(>_<)

いつもこれじゃ足りないだろ・・とか思いながらも
分からなくて結局提出してしまっていたんですが、
色々なアプローチの仕方があるんですね！

これ読んでがんばって考えてみようって思いました(・_・´)
ありがとうございました！

回答No.2

yanachu

補足お願いします。

主さんの目的はなんですか？

学校の実験のレポートですか？高校？大学？

それとも研究室で行っている研究に際しての疑問ですか？

それによって回答の仕方が変わってくると思いましたので、教えてください。

（今回答を書いていたんですが、ふと「もしかして学生さんのレポートかも？」と思いまして。
　もしそうであれば、私の用意していた回答は不適当だと思ったので、確認のためお聞きしています）

補足

遅くなってしまい申し訳ありません。

大学の実験です。
栄養科学科の生化学の実験をやっています(>_<)

よろしくおねがいします。

回答No.1

yanachu

確かにおおざっぱすぎますね。なのでおおざっぱな回答しかできませんが…

活性が低下とおっしゃってますが、タンパク質量と活性値の比を調べていますか？
精製の段階を追うごとに、活性値／総タンパク質量の値が著しく低下しているのだったら、酵素変性・分解により活性が落ちているのではないでしょうか。

・酵素の安定化剤をバッファーに加えていますか？

・インベルターゼの活性の至適温度は高いようですが、粗精製品にはプロテアーゼなどインベルターゼを分解する酵素も含まれていますよね。
できれば酵素の精製は低温で行うべきかと思います。

・エタ沈は酵素が変性しやすくないですか？そのあたりの確認は取れていますか？

タンパク質量と活性の比は低下していなければ、単に収率の問題で、精製の過程でロスが大きいのだと思います。
試しに、精製途中で捨てている画分の活性のトータル量も調べてみてください。

１００％の収率で精製するのは無理でしょうが、できるだけ高い収率で酵素を回収できるよう、精製方法の工夫が必要だと思います。

お礼

回答ありがとうございます。
遅くなってしまってすみません。

・活性が低下とおっしゃってますが、タンパク質量と活性値の比を調べていますか？
→活性はソモギー・ネルソン法によって検量線を作成し、還元糖量→スクロース加水分解量→用いた全酵母中の総インベルターゼ活性→酵母10gあたりの総インベルターゼ活性の順に調べました。
反応時間は10分で、50℃の水浴中で行いました。

一段階目の粗抽出を行ったあとに、酢酸緩衝液を加え、また各精製操作が終わる度にカビ防止のためにゲンタマイシンを添加しました。

・インベルターゼの活性の至適温度は高いようですが、粗精製品にはプロテアーゼなどインベルターゼを分解する酵素も含まれていますよね。
→酵素の精製は氷水中で行い、エタノールなどの試薬も冷蔵保蔵していたものを用いました。

エタ沈が酵素変性しやすい操作であるということは知りませんでした(>_<)

yanachuさんの回答を参考に考えてみたのですが、エタ沈によって酵素が一部変性してしまったために活性が低下してしまったと考えてよいでしょうか？
よろしかったら返信お願いします。