ヒト末梢血単核球の播種条件

質問

どなたか助けて下さい。
困っています。ヒト末梢血単核球を用いて研究しています。
ＩＬ－１ｂで刺激後の細胞内タンパクの変化をウエスタンブロッティング法
にて検討したいのですが、うまくいきません。
分離はロイコプロールを用いて遠心分離しています。
細胞数をカウントすると細胞はとれているようなのですが、
50ml の血液からとった細胞を 6well dish に１×１０の７乗ぐらいで細胞を播いてタンパクの回収を行っうとたんぱく量がほとんどとれません。他の細胞では問題ないので、培養や播種条件に問題があると考えています。ヒト末梢血単核球をウエスタンブロットで解析するうえでの培養条件や播種条件のプロトコールを教えていただけないでしょうか？よろしくお願いいたします。

回答No.1

alanami

思いついたままに原因を書いてみます。
クリアできているようでしたら無視してください。

ウエスタンで使用する抗体等はうまく作用していることを
前提に書きます。

・PBMCs由来の全血が新鮮でない。
・全血からPBMCsがうまく分取できていない。
→個人差はありますが全血50mlですと、PBMCsは5 X 10の7乗位取れると思います。
・IL-1bの濃度或いはインキュベーション時間が足りない。
・IL-1b刺激後のDishに付着した細胞を回収できていない。
・他の細胞は腫瘍細胞株を予想しますが、腫瘍細胞程のタンパク量を
　PBMCsで確保できていない。
・私は通常1 X 10の6乗のPBMCsを24wellプレートに播種しています。
→1 X 10の7乗のPBMCsを6wellプレート１つに播種は少々濃いかもしれません。

お礼

早速ご回答いただきまして誠にありがとうございます。
もう一度トライしてみます。

あと一つだけお聞きしてもよろしいですか？
24 well プレートでも十分量のタンパクがとれるのですね～
細胞は非常に小さい点のような細胞（大多数）ともう少し大きいマクロファージ用の細胞（少数）が
観察できるのですが、そんなもんですか？
ちなみに、接着しているのは大きいほうの細胞のようです。